細胞色素C誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡作用機制的探討.pdf

1、[目的]通過不同濃度細胞色素C作用于離體的HL-60細胞，探討其誘導(dǎo)凋亡的可能的分子機制，為把細胞色素C用于白血病的治療提供理論依據(jù)。 [方法]1、用MTT檢測不同濃度和時間的細胞色素C對HL-60細胞生長的抑制率。 2、用普通光鏡、熒光顯微鏡檢測不同濃度的細胞色素C作用于HL-60細胞后細胞發(fā)生的形態(tài)變化。 3、用流式細胞儀檢測不同濃度的細胞色素C對HL-60細胞促凋亡作用及細胞周期的變化并進行凋亡定量分析。

2、 4、利用DNA凝膠電泳技術(shù)觀察不同濃度的細胞色素C作用于HL-60細胞其DNA凝膠電泳的變化。 5、采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測不同濃度的細胞色素C作用于HL-60細胞后凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Fas表達的變化并進行半定量分析。 6、采用westernblotting技術(shù)檢測不同濃度的細胞色素C作用于HL-60細胞后凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Fas表達的變化并進行半定量分析 [結(jié)果]1、

3、不同濃度的細胞色素C對體外培養(yǎng)的HL-60細胞其抑制作用隨著細胞色素C濃度的增加和作用時間的延長，抑制率逐漸增加。MTT結(jié)果表明當加入細胞色素C濃度分別是0、9.375mg/L、18.75mg/L、37.5mg/L、75mg/L、150mg/L作用于HL-60細胞24h，其抑制率分別是(0±0.00)％、(7.809±1.495)％、(18.023±1.687)％、(36.917±3.979)％、(65.004±4.496)％和(79.

4、833±4.837)％，細胞色素C在0～150mg/L的范圍內(nèi)對HL-60的抑制率是逐漸升高的。 2、DNA熒光染料Hoechst33342和碘化丙啶(PI)雙染HL-60細胞后觀察其形態(tài)學變化：經(jīng)上述終濃度處理的細胞用Hoechest33342、PI雙染后于熒光顯微鏡下觀察可見處理組細胞出現(xiàn)細胞核明顯固縮、凝聚和斷裂，并出現(xiàn)凋亡小體，在0～37.5mg/L時，隨著細胞色素C濃度的增加，出現(xiàn)凋亡細胞明顯增多，在37.5mg/L時

5、凋亡率最高，當細胞色素C濃度大于37.5mg/L時，細胞凋亡率并不增加，而是下降，且出現(xiàn)細胞壞死，而空白對照HL-60細胞核染色質(zhì)均勻。 3、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：加入細胞色素C濃度分別是0、9.375mg/L、18.75mg/L、37.5mg/L、75mg/L、150mg/L作用于HL-60細胞24h，當細胞色素C濃度在0～37.5mg/L時，細胞凋亡逐漸增加，在37.5mg/L，凋亡率最高；當細胞色素C濃度大于37.5mg/L

6、時，細胞凋亡率反而降低，其凋亡率分別為(0±0)％、(4.52±0.901)％(12.39±1.369)％、(21.98±3.296)％、(15.75±2.005)％、(8.11±2.193)％。 4、細胞色素C誘導(dǎo)HL-60凋亡的作用與細胞周期密切相關(guān)，隨凋亡的增加，G1期比率隨之增加，其二者呈正相關(guān)。 5、DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示：當用上述細胞色素C處理的細胞獲得的DNA電泳時出現(xiàn)了典型的“梯狀條帶”。且細胞色素

7、C濃度在0～37.5mg/L時，隨細胞色素C濃度增加，條帶越明顯。 6、RT-PCR技術(shù)檢測不同濃度的細胞色素C作用于HL-60細胞24小時后其相關(guān)凋亡基因Bcl-2、Fas表達隨細胞色素C濃度的不同而不同。 7、用westemblotting技術(shù)檢測不同濃度的細胞色素C作用于HL-60細胞24小時后其相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、Fas表達隨細胞色素C濃度的不同而不同。 [結(jié)論]1、細胞色素C可明顯抑制乩-60細胞的