肺癌細(xì)胞株中miRNA的篩選及miR-544a促進(jìn)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。由于肺癌病人早期癥狀不典型,同時(shí)缺乏敏感的篩查指標(biāo)及有效的早期確診方法,大多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)處于疾病中晚期,錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)。肺癌患者另一個(gè)預(yù)后不良的重要原因是容易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,即使早期患者在腫瘤完全切除的情況下也大多死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此進(jìn)一步研究肺癌轉(zhuǎn)移的的分子機(jī)制,將有助于預(yù)防肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。miRNAs是一種新型腫瘤標(biāo)記物。致癌類miRNAs通過(guò)下調(diào)抑癌基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),抑癌

2、類miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)抑制原癌基因的表達(dá)而抑制腫瘤。深入研究miRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用,將為肺癌的診斷和治療提供新的方案和新的靶點(diǎn)。
　　1.篩選差異表達(dá)的miRNAs
　　以兩株不同轉(zhuǎn)移能力的肺癌細(xì)胞株95C和95D為研究對(duì)象。提取總RNA后,利用miRNAs芯片對(duì)95C和95D的miRNA譜系分析篩選,獲得具有差異表達(dá)的 miRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在95C和95D中,microRNAs表達(dá)存在差異:其中mi

3、R-544a、miR-320、miR-22、miR-103、miR-565和miR-23a等microRNAs,在高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株95D中高表達(dá);miR-135b、miR-455-5p、miR-196a、miR-448、miR-888、miR-193a-5p、miR-28-5p和 miR-139-5p等 microRNAs,在低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株95C中高表達(dá)。
　　miRNA芯片檢測(cè)靈敏度較高,但存在一定的假陽(yáng)性率。因此通過(guò)QPCR

4、對(duì)差異miRNA進(jìn)行驗(yàn)證,從而降低假陽(yáng)性率。QPCR結(jié)果顯示,miR-544a在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株95D中的相對(duì)表達(dá)水平上調(diào),其相對(duì)表達(dá)水平約是95C的3倍。該結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。
　　2. miR-544a通過(guò)下調(diào)CDH1、上調(diào)Vimentin促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲能力
　　利用TargetScans數(shù)據(jù)庫(kù),檢索到miR-544a與CDH1、GSK-3β有高分?jǐn)?shù)結(jié)合,提示CDH1、GSK-3β可能是miR-544a的靶基因。本實(shí)

5、驗(yàn)進(jìn)而采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來(lái)加以驗(yàn)證。在CDH1或GSK-3β野生型重組質(zhì)粒中,與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-544a mimic后,熒光強(qiáng)度比值明顯降低。結(jié)果表明CDH1、GSK-3β是miR-544a的靶基因。
　　進(jìn)而采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法,將 miR-544a mimic轉(zhuǎn)染到低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株95C中,進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Western blot等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲能力的變化以及CDH1、Viment

6、in等蛋白表達(dá)水平的變化。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)、CDH1下調(diào)、Vimentin上調(diào)。
　　3. miR-544a通過(guò)下調(diào)GSK-3β使肺癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞的特征
　　將miR-544a的序列克隆到pBaBe-puro載體中,構(gòu)建了能表達(dá)成熟miR-544a的載體,進(jìn)而轉(zhuǎn)染95C和95D,經(jīng)QPCR驗(yàn)證:獲得了穩(wěn)定表達(dá)miR-544a的細(xì)胞系。進(jìn)一步通過(guò)Western blot和腫瘤球懸浮培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究miR-544a與腫

7、瘤干細(xì)胞的關(guān)系。
　　Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,95C、95D轉(zhuǎn)染miR-544a后,GSK-3β表達(dá)降低,β-catenin和CD133表達(dá)增高。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明GSK-3β作為miR-544a的靶基因,受到miR-544a的抑制,導(dǎo)致GSK-3β下降;GSK-3β下降后,β-catenin的降解減少,其濃度升高,激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移,增殖能力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),95

8、C、95D轉(zhuǎn)染 miR-544a后,腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志CD133表達(dá)增高,轉(zhuǎn)染細(xì)胞能形成腫瘤球,說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-544a的95C細(xì)胞具有了腫瘤干細(xì)胞的特征。
　　從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出結(jié)論如下:
　　1)miR-544a在肺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株95D中呈高表達(dá)。
　　2)CDH1、GSK-3β為miR-544a的靶基因。
　　3)miR-544a可以下調(diào)CDH1,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT,促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　4)mi