非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K與細(xì)胞自噬和死亡關(guān)系的研究.pdf

1、真核延伸因子2激酶(eEF2K)是一種Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶，eEF2是其已知的唯一底物。eEF2K催化eEF2的Thr56位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致降低eEF2與核糖體的結(jié)合能力進(jìn)而抑制肽鏈延伸。通過近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，許多類型的癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)eEF2K高表達(dá)或高度活化，尤其是在膠質(zhì)瘤、乳腺癌中最為明顯。eEF2K表達(dá)水平或者活性的改變還將影響細(xì)胞的許多生理進(jìn)程，例如，細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及自噬等。其中eEF2K活性水平的改

2、變與細(xì)胞自噬進(jìn)程的調(diào)控又是其中的熱點(diǎn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)eEF2K活性增強(qiáng)能夠誘導(dǎo)自噬，抑制eEF2K活性誘導(dǎo)的自噬能夠增加多種藥物的有效性。到目前為止對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K的研究還基本處于空白階段。吉非替尼為為EGFR酪氨酸激酶抑制劑的代表藥物，也是臨床上常用的治療非小細(xì)胞肺癌的藥物，但是隨著作用時(shí)間的延長會(huì)逐漸出現(xiàn)耐藥，限制了吉非替尼的應(yīng)用。
　　本課題目的:旨在觀察在非小細(xì)胞肺癌中eEF2K是否與細(xì)

3、胞自噬和死亡存在聯(lián)系并研究eEF2K是否參與吉非替尼的耐藥，為將來eEF2K作為抗腫瘤靶標(biāo)提供更加充實(shí)的證據(jù)。
　　第一部分非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中吉非替尼誘導(dǎo)eEF2K活化與細(xì)胞自噬
　　在本部分實(shí)驗(yàn)中采用吉非替尼處理非小細(xì)胞肺癌發(fā)現(xiàn)，吉非替尼能夠顯著增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌株H1975和A549中eEF2K的活性且具有一定的時(shí)間和劑量依賴性。通過免疫沉淀對自噬相關(guān)蛋白LC3和P62檢測、免疫熒光檢測自噬體顆粒狀的形成以及通過透射電鏡

4、對自噬體形成的檢測，發(fā)現(xiàn)吉非替尼能夠?qū)е路切〖?xì)胞肺癌中自噬活性且具有時(shí)間和劑量依賴性。而且還發(fā)現(xiàn)由吉非替尼引起的eEF2K活性增加以及自噬活性增強(qiáng)在時(shí)間和濃度上存在一致性，表明兩者可能存在某種聯(lián)系。
　　第二部分非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K與細(xì)胞自噬和死亡關(guān)系的研究
　　1、抑制eEF2K活性或干擾其表達(dá)后對由吉非替尼引發(fā)自噬的影響
　　通過貧血清方法測定A484954在非小細(xì)胞肺癌中抑制eEF2K最適作用濃度100

5、uM以及最適作用時(shí)間為6h，然后通過采用eEF2K小分子抑制劑以及加入其干擾片段抑制eEF2K的活性或者表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)對由吉非替尼引起的自噬沒有影響。并且通過對同樣能夠引起非小細(xì)胞肺癌株中eEF2K活性升高以及自噬活性增強(qiáng)的化合物Stattic試驗(yàn)，也得出同樣的結(jié)論。
　　2、吉非替尼引起的自噬和eEF2K活性對細(xì)胞生存的影響
　　eEF2K的抑制并不能對由吉非替尼引起的自噬產(chǎn)生影響，接下來分別對由吉非替尼引起的eEF2K活性

6、升高、自噬活性增強(qiáng)及細(xì)胞生存能力情況三者進(jìn)行探討。發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌株中通過3-MA抑制自噬的活性能夠明顯增強(qiáng)吉非替尼的藥效，而通過A484954抑制eEF2K活性或者干擾其表達(dá)后在吉非替尼處于高濃度的情況下能夠降低吉非替尼的藥效，使得細(xì)胞生存能力增強(qiáng)且這種增強(qiáng)作用在提前將eEF2K活性抑制后效果更為明顯。
　　3、eEF2K在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的作用及作用機(jī)制初探
　　在無吉非替尼作用下，通過A549細(xì)胞干擾eEF2K后

7、細(xì)胞計(jì)數(shù)和平板克隆發(fā)現(xiàn)eEF2K被抑制以后能夠?qū)е录?xì)胞生存能力的增加，并能夠引起自噬活性的增強(qiáng)。而在乳腺癌細(xì)胞中eEF2K被抑制可以減少自噬并抑制乳腺癌細(xì)胞生長。通過本研究我們初步明確了抑制eEF2K對吉非替尼引起的自噬無明顯影響和導(dǎo)致細(xì)胞存活增加的原因可能是在非小細(xì)胞肺癌中eEF2K自身可抑制細(xì)胞自噬與細(xì)胞增殖。
　　意義:通過本課題研究確定了在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中eEF2K不參與吉非替尼介導(dǎo)的耐藥并且還發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株