miR-33a調(diào)控人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　微RNA(microRNA, miRNA)是一類(lèi)非編碼小RNA，長(zhǎng)約22nt，其可通過(guò)與靶基因mRNA的3’-UTR堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制靶基因的表達(dá)。近年來(lái)，miRNA被報(bào)道參與腫瘤轉(zhuǎn)移，但其調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，最顯著的標(biāo)志就是上皮標(biāo)志物的丟失和間葉標(biāo)志物表達(dá)上升，其可使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間

2、質(zhì)型細(xì)胞，已被報(bào)道不僅參與胚胎發(fā)育過(guò)程中的組織形成而且是增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的主要機(jī)制。但是，其調(diào)控信號(hào)通路和具體機(jī)制仍未完全闡明。越來(lái)越多的研究表明，包括人類(lèi)腫瘤增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移在內(nèi)的人類(lèi)疾病可能與某些特定的miRNA表達(dá)異常有關(guān)。這些研究結(jié)果均提示我們，一些 miRNA可參與調(diào)控 EMT。miR-33a，在代謝和代謝性疾病中經(jīng)常出現(xiàn)異常表達(dá)，但它在EMT和轉(zhuǎn)移中的作用至今研究甚少。本課題中我們主要研究miR-33a在人非小細(xì)胞肺

3、癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細(xì)胞EMT中的作用及其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：
　　（1）通過(guò)生物信息學(xué)法篩選發(fā)現(xiàn)miR-33a與EMT相關(guān)基因Twist1之間的潛在靶點(diǎn)關(guān)系。
　　（2）根據(jù)miRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成miR-33a的mimics、inhibitor及其陰性對(duì)照。用脂質(zhì)體將miR-33a的mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染NCI-H1299和SPC-A-1

4、細(xì)胞，分別提高和降低細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)miRNA的水平，并用熒光定量RT-PCR分析轉(zhuǎn)染后miR-33a細(xì)胞中的表達(dá)變化以確認(rèn)轉(zhuǎn)染效果。
　　（3）用熒光定量RT-PCR分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)miR-33a的mimics、inhibitor后Twist1在mRNA表達(dá)水平上的變化，同時(shí)用Western Blot分析Twist1蛋白表達(dá)變化。
　?。?）用雙熒光素酶分析系統(tǒng)進(jìn)一步確認(rèn)miR-31與Twist1之間的靶點(diǎn)調(diào)控關(guān)系。
　　

5、（5）應(yīng)用熒光定量RT-PCR和Western Blot以及劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別分析轉(zhuǎn)染miR-33amimics，miR-33a inhibitor和Twist1siRNA后NSCLC細(xì)胞EMT及轉(zhuǎn)移能力的變化，評(píng)價(jià)miR33a和Twist1表達(dá)水平變化對(duì)NSCLC細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）不同轉(zhuǎn)移能力的NSCLC細(xì)胞中，其miR-33a的表達(dá)亦有顯著性差異，miR-33a的表達(dá)與

6、NSCLC細(xì)胞遷移能力呈負(fù)相關(guān)。
　?。?）上調(diào)miR-33a表達(dá)引起上皮標(biāo)志物CDH1表達(dá)增加，間葉標(biāo)志物Vimentin表達(dá)下降，細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力降低，即抑制細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移。
　?。?）下調(diào)miR-33a表達(dá)則導(dǎo)致上皮標(biāo)志物CDH1表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)上升，細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力增強(qiáng)，即誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移。
　?。?）下調(diào)Twist1表達(dá)，CDH1表達(dá)增加，Vimentin表達(dá)降低，細(xì)

7、胞遷移和浸潤(rùn)能力降低，即抑制細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移。
　?。?）在NSCLC細(xì)胞中，miR-33a與Twist1表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，并且miR-33a負(fù)調(diào)控Twist1的表達(dá)。
　?。?） Twist1基因是miR-33a的直接作用靶點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　?。?） miR-33a表達(dá)與NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力呈顯著負(fù)相關(guān)；其異常表達(dá)與細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　（2） miR-33a抑制 NSCLC細(xì)胞的EMT