玉竹提取物A對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的影響.pdf

1、目的：
　　 玉竹(Polygonatum Odoratum(Mill.)Druce)是百合科黃精屬中草藥,藥用根莖中含有多糖、黃酮、生物堿、甾體皂苷、甾醇、鞣質(zhì)、黏液質(zhì)和強(qiáng)心苷等多類成分?，F(xiàn)代藥效學(xué)研究證明玉竹有抑制免疫功能、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老和降血糖等作用。玉竹提取物A是一種醇水提取物,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制細(xì)胞免疫功能和炎癥反應(yīng)的特點(diǎn),前期試驗(yàn)已經(jīng)證明一定濃度的玉竹提取物A可以抑制炎癥細(xì)胞釋放IL-1和TNF-α等促炎癥

2、細(xì)胞因子,鑒于玉竹提取物A具有低毒和安全的特點(diǎn),進(jìn)一步研究其在抗炎方面的作用和機(jī)制是非常必要的。
　　 一氧化氮(Nitric oxide,NO)參與炎癥及免疫反應(yīng)等過程,在病理情況下合成的大量NO會(huì)引起急、慢性炎癥反應(yīng)。內(nèi)源性的NO是由一氧化氮合成酶(NOsynthase,NOS)氧化L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生的。NOS有三種同功酶即內(nèi)皮型(endothelial NOS,eNOS或NOS-Ⅲ)、神經(jīng)型(neuronal N

3、OS,nNOS或NOS-Ⅰ)和誘生型(inducible NOS,iNOS或NOS-Ⅱ)。iNOS只在炎癥細(xì)胞受到刺激被激活后才表達(dá),尤其是巨噬細(xì)胞。iNOS主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,誘導(dǎo)iNOS的刺激物包括血紅素、脂多糖、細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-1α等。許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),體內(nèi)iNOS被激活后,釋放出的大量NO與多種病理改變相關(guān),包括組織損傷和多種炎癥疾病、神經(jīng)疾病和自身免疫性疾病等。因此,選擇性的抑制iNOS進(jìn)而抑制過量NO產(chǎn)

4、生,將對(duì)以上疾病的治療具有一定的應(yīng)用前景。iNOS抑制劑具有阻斷炎癥信息傳遞通道的作用,有效地抑制iNOS不僅能在初始階段影響炎癥的發(fā)生,也對(duì)抑制和終結(jié)炎癥有作用。
　　 前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),玉竹提取物A在一定程度上能抑制由LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子(如IL-1和TNF-α),達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果,同時(shí)研究玉竹提取物A能否對(duì)炎癥損傷中占有重要作用的炎癥介質(zhì)NO同樣起到抑制作用,并且進(jìn)一步

5、揭示其內(nèi)在機(jī)制。研究玉竹提取物A對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介貢--NO、IL-6和TNF-α的影響的同時(shí),也檢測玉竹提取物A對(duì)iNOS表達(dá)的影響。從而進(jìn)一步驗(yàn)證玉竹提取物A對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 取清潔級(jí)6-8周齡雌性BALB/c小鼠4只,無菌條件下取小鼠腹腔細(xì)胞,于37℃5％CO2條件下培養(yǎng)1 h,去除未貼壁細(xì)胞,貼壁的巨噬細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,收集、離心和清洗后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度

6、為2×106/ml。臺(tái)盼藍(lán)染色,細(xì)胞活力>99％,即為提純的腹腔巨噬細(xì)胞,備用。將提純的腹腔巨噬細(xì)胞以2×106/ml的密度加入96孔培養(yǎng)板中,實(shí)驗(yàn)分組包括空白對(duì)照組(巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)基)和玉竹提取物A各濃度實(shí)驗(yàn)組(15.625-1000μg/ml玉竹提取物A+巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)基),各孔終體積均為200μl,細(xì)胞終密度是1×106/ml,一式5復(fù)孔。在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h,MTT法檢測巨噬細(xì)胞存活率。將上述提純的腹腔巨噬細(xì)胞以同樣密度分

7、別加入兩塊96孔培養(yǎng)板中,采取同樣分組,空白對(duì)照組(巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)基)、LPS對(duì)照組(LPS+巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)基)和玉竹提取物A各濃度實(shí)驗(yàn)組(250-1000 μg/ml玉竹提取物A+LPS+巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)基)。其中一塊板在37℃5％CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6h,采用ELISA法檢測上清中IL-6和TNF-α的水平；其中另一塊板在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h,Griess法檢測上清中NO的水平。同時(shí)用Western blotting法檢測細(xì)胞中i

8、NOS表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示,經(jīng)t檢驗(yàn)處理,p<0.05為差異顯著。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn),玉竹提取物A在15.625-1000μg/ml濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活力無明顯影響,沒有直接的細(xì)胞毒作用。通過ELISA檢測,結(jié)果證明玉竹提取物A在500-1000μg/ml的劑量范圍內(nèi)具有明顯抑制LPS活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α的作用(p<0.05),并

9、具有一定劑量依賴性。經(jīng)Griess法檢測,結(jié)果證實(shí)玉竹提取物A在250-1000μg/ml的劑量范圍內(nèi)可明顯抑制活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO(p<0.05),也呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。通過Westernblotting法檢測,結(jié)果表明1000μg/ml玉竹提取物A能夠在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO,是通過下調(diào)iNOS的表達(dá)而達(dá)到的。
　　 討論：
　　 本實(shí)驗(yàn)研究了玉竹提取物A對(duì)活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞

10、增殖抑制的作用,證明玉竹提取物A在15.625-1000μg/ml濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活力無明顯影響。通過檢測玉竹提取物A對(duì)活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子的抑制作用,得出在500-1000μg/ml的劑量范圍內(nèi)玉竹提取物A具有明顯抑制IL-6和TNF-α這些促炎癥細(xì)胞因子的作用,同時(shí),也具有一定劑量依賴性。
　　 研究玉竹提取物A對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制作用證實(shí)玉竹提取物A在250-1000μg/ml的

11、劑量范圍內(nèi)可明顯抑制活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO(p<0.05),并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。
　　 通過Western blotting法檢測玉竹提取物A對(duì)iNOS表達(dá)的影響。結(jié)果表明高濃度玉竹提取物A能夠一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO,是通過下調(diào)iNOS的表達(dá)而達(dá)到的。
　　 巨噬細(xì)胞具有非特異性吞噬和抗原提呈的功能,在非特異性和特異性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用。巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答是機(jī)體發(fā)揮防御機(jī)制

12、的基礎(chǔ),當(dāng)細(xì)菌侵入機(jī)體繁殖和被殺滅時(shí),有大量的內(nèi)毒素釋放到體液中,刺激巨噬細(xì)胞的活化并釋放過量的炎癥因子,如NO、TNF-α、IL-6等,從而造成瀑布式的炎癥失控性反應(yīng),使組織損傷并成為炎癥?；罨木奘杉?xì)胞通過iNOS途徑產(chǎn)生大量的NO,iNOS是NO產(chǎn)生的三種重要酶類之一。通過對(duì)iNOS的調(diào)控,從而控制活化巨噬細(xì)胞對(duì)NO的釋放,以至于調(diào)控免疫功能。以上結(jié)果提示玉竹提取物A很有可能是一種新型有效的抗炎藥物的候選者,從中草藥中篩選出新的低

13、毒安全的抗炎藥物可能是一條有效的途徑。
　　 由于傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥物被報(bào)導(dǎo)稱有包括增加心血管風(fēng)險(xiǎn)等在內(nèi)的較多副作用,因此,新型安全的抑制炎癥藥物的研究與開發(fā)勢在必行。已有研究表明,玉竹提取物A是一種低毒安全的中藥提取物(其半數(shù)致死率LD50用寇氏法計(jì)算為14.5124 g/kg)。研究玉竹提取物A在炎癥及免疫疾病中的應(yīng)用價(jià)值,為臨床應(yīng)用玉竹提取物A治療炎癥疾病和中藥玉竹的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。
　　 結(jié)論：<