小鼠子宮特絡(luò)細(xì)胞(Telocytes)對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞體外活化效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　Telocytes（TCs）是一種普遍存在于人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物器官和組織中的特殊間質(zhì)細(xì)胞。近年來(lái)逐漸深入研究的結(jié)果顯示，TCs可能通過(guò)細(xì)胞間連接來(lái)調(diào)節(jié)局部的免疫微環(huán)境。婦科疾病，諸如子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥，均與免疫有密切關(guān)系，而 TCs潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，在婦科疾病中尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究體外條件下，間接共培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（pMACs）在子宮 TCs的刺激下產(chǎn)生的形態(tài)，活力以及分泌功能的變化，旨在了解子宮TCs在局

2、部免疫環(huán)境調(diào)節(jié)中起到的作用以及潛在影響。
　　方法：
　　選取SPF級(jí)BALB/c小鼠用作TCs原代細(xì)胞培養(yǎng)和腹腔巨噬細(xì)胞的分離提取。1.過(guò)量麻醉處死小鼠，無(wú)菌條件下取小鼠子宮組織，用酶消化的方法提取TCs進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2.采用亞甲藍(lán)染色，活細(xì)胞線粒體染色和免疫熒光染色（vimentin，CD34及c-kit）等方法鑒定并觀察TCs細(xì)胞形態(tài)。
　　3.顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察并拍攝照片，記錄TCs細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及T

3、ps（TCs細(xì)胞特有的極細(xì)長(zhǎng)串珠狀突起）的形態(tài)變化。
　　4.流式細(xì)胞方法標(biāo)記（vimentin及CD34）檢測(cè)培養(yǎng)TCs細(xì)胞純度。
　　5.TCs傳代并生長(zhǎng)穩(wěn)定后，加入不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清，即Telocytes條件培養(yǎng)基（TCM）。
　　6.無(wú)菌條件下，向小鼠腹腔內(nèi)注射巰基乙醇酸鹽，刺激腹腔巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生。三天后用腹腔沖洗的方法提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（pMACs）。
　　7.用TCM培

4、養(yǎng)pMACs作為實(shí)驗(yàn)組，空白培養(yǎng)基培養(yǎng)pMACs作為陰性對(duì)照組，空白培養(yǎng)基加脂多糖（LPS）培養(yǎng)pMACs作為陽(yáng)性對(duì)照組，建立間接共培養(yǎng)模型。
　　8.觀察48 h后巨噬細(xì)胞形態(tài)，用CCK-8法測(cè)定巨噬細(xì)胞活性。巨噬細(xì)胞線粒體熒光染色，拍照記錄并分析熒光強(qiáng)度。分別收集24 h及48 h培養(yǎng)細(xì)胞上清液，用Elisa法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子水平（iNOS，IL-6，TNF-α，IL1-R1，IL-10，TGF-β1，IL-1β，IL-23α

5、及 IL-18）。探討pMACs受到TCs間接刺激后形態(tài)，活力及分泌功能的變化。
　　結(jié)果：
　　1.顯微鏡下小鼠子宮TCs具有典型的形態(tài)特點(diǎn)，胞體較小，但具有極為細(xì)長(zhǎng)的胞質(zhì)突起（Tps），并且粗細(xì)交替。亞甲藍(lán)染色下能更清楚地觀察細(xì)胞核和Tps形態(tài)。
　　2.熒光顯微鏡下觀察，TCs呈vimentin陽(yáng)性，CD34陽(yáng)性和c-kit陰性表達(dá)。
　　3.動(dòng)態(tài)拍攝記錄可觀察到TCs細(xì)胞胞體明顯的移動(dòng)和變化，胞體遷移過(guò)程

6、中Tps逐漸延長(zhǎng)。
　　4.流式細(xì)胞方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，vimentin和CD34雙陽(yáng)性細(xì)胞占90％以上。
　　5.TCM培養(yǎng) pMACs后，pMACs發(fā)生了明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞伸出偽足，胞膜粗糙，胞漿內(nèi)充滿(mǎn)顆粒感，但未發(fā)生皺縮和死亡，細(xì)胞間隙被變形的細(xì)胞偽足填滿(mǎn)。而陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，LPS刺激組細(xì)胞在 LPS作用下已開(kāi)始發(fā)生細(xì)胞皺縮和死亡，細(xì)胞間隙明顯增大。
　　6.CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性后，實(shí)驗(yàn)組較陰性

7、對(duì)照組活性明顯升高（p<0.05），相較LPS刺激組無(wú)明顯差別(p>0.05)。
　　7.巨噬細(xì)胞線粒體熒光染色，使用熒光顯微鏡附帶軟件分析熒光強(qiáng)度。陰性對(duì)照組9732.27?1996.87；陽(yáng)性對(duì)照組：21939.16?2159.58；TCM培養(yǎng)組：29478.73?3652.01，相較于陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。
　　8.細(xì)胞因子定量測(cè)定：在受到 TCs間接刺激的 pMACs培養(yǎng)上清液中，iN

8、OS和IL-6在24和48小時(shí)都有顯著增高（p<0.05）。TNF-α，IL1-R1和IL-10，雖然升高不顯著，但48小時(shí)數(shù)據(jù)仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。TGF-β1，IL-1β,IL-23α和IL-18的數(shù)據(jù)結(jié)果在三組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）
　　結(jié)論：
　　原代培養(yǎng)的子宮TCs在間接共培養(yǎng)條件下對(duì)pMACs產(chǎn)生了明顯的活化作用，使pMACs的形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，細(xì)胞活力有明顯的提高，分泌的部分免疫相關(guān)細(xì)胞因