5-FC對CD基因修飾的SHG-44惡性人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的研究.pdf

1、背景與目的：腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，盡管近年來在手術(shù)、放療、化療和免疫治療等方面已取得很大進(jìn)展，但療效仍不樂觀，5年生存率不足50％。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，使基因治療膠質(zhì)瘤成為可能，而自殺基因治療是其中的一種重要方法。經(jīng)典自殺基因一般編碼非哺乳動物酶類，可將無毒的前藥轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨拘源x產(chǎn)物。因此，全身使用無毒性前藥可導(dǎo)致腫瘤部位毒性藥物產(chǎn)生并發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。胞嘧啶脫氨酶(CD)僅存在于酵母或細(xì)菌體內(nèi)，哺乳動物細(xì)

2、胞內(nèi)不含該酶，它可將抗真菌藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)。本研究在離體狀態(tài)下將CD基因轉(zhuǎn)染SHG-44惡性人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，建立CD／5-FC自殺基因系統(tǒng)：進(jìn)而通過體外試驗探討CD／5-FC系統(tǒng)能否抑制惡性人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長及其作用機理，以期為CD／5-FC系統(tǒng)在體治療膠質(zhì)瘤試驗打下基礎(chǔ)，為該治療系統(tǒng)盡快步入臨床提供實驗資料。 方法：1．將所獲取的pCMVCD表達(dá)質(zhì)粒擴增并抽提純化，限制性內(nèi)

3、切酶Bam HI和Not I酶切鑒定pCMVCD質(zhì)粒。分別以SP6與T7啟動子進(jìn)行CD基因測序。2.SHG-44細(xì)胞在含10％FBS／DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。3．離體狀態(tài)下采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000試劑將pCMVCD表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞。經(jīng)G418篩選培養(yǎng)，2-3周后獲取G41 8抗性細(xì)胞克隆(即SHG-44／CD細(xì)胞)。免疫細(xì)胞化學(xué)試驗檢測SHG．44／CD細(xì)胞CD抗體表達(dá)。4．將SHG-44／CD和SHG

4、-44細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，加入含不同濃度的5-FC培養(yǎng)液培養(yǎng)。第7天采用常規(guī)MTT法進(jìn)行比色分析，確定活細(xì)胞比率。5．將SHG-44／CD細(xì)胞和SHG-44細(xì)胞按一定比例混合，加入5-FC后7天按MTT法測細(xì)胞存活率，檢測CD／5-FC自殺基因治療系統(tǒng)是否存在“旁觀者效應(yīng)”。6．采用流式細(xì)胞儀、TUNEL實驗法及透射電子顯微鏡評價5-FC對SHG-44／CD細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。7．所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行處理。

5、 結(jié)果：1．限制性內(nèi)切酶Bam HI和Not I消化證實CD基因插入真核表達(dá)載體的多克隆位點。CD基因編碼區(qū)為1284 bp，與基因庫收錄序列完全一致。 2．SHG-44細(xì)胞在10％FBS／DMEM培養(yǎng)液中生長良好；通過脂質(zhì)體將含CD基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入SHG-44細(xì)胞，G418篩選獲得抗性克隆SHG-44／CD細(xì)胞，CD抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示SHG-44／CD細(xì)胞成功地表達(dá)了CD。3．MTT法顯示：轉(zhuǎn)染CD基因的SHG-44／C

6、D細(xì)胞在低濃度5-FC培養(yǎng)液孵育7天后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡，IC50為 10 μ mol／L；而未轉(zhuǎn)染的SHG-44細(xì)胞對5-FC不敏感，IC<,50>約為6500 μ mol／L；二者相比有顯著性差異(p<0.05)。SHG-44和SHG-44／CD細(xì)胞在1000 μmol／L 5-FC作用下，形態(tài)學(xué)有明顯不同，7天后SHG-44細(xì)胞生存狀態(tài)良好，SHG-44／CD細(xì)胞則出現(xiàn)生長抑制和死亡。4．CD／5-FC自殺基因治療系統(tǒng)存在“旁觀

7、者效應(yīng)”，可以殺傷未轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，細(xì)胞存活率與兩種細(xì)胞混合比例以及5-FC濃度密切相關(guān)，它們之間存在顯著性差異(p<0.05)。 5.轉(zhuǎn)染CD基因的SHG-44／CD細(xì)胞和SHG-44細(xì)胞在含5-FC的培養(yǎng)液中培養(yǎng)72h，TUNEL顯示絕大多數(shù)細(xì)胞胞核呈黃染表現(xiàn)，凋亡細(xì)胞比例極高，SHG-44細(xì)胞則未見胞核黃染現(xiàn)象：透射電鏡鏡下可見SHG-44／CD細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征性改變，但SHG-44細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象；流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，SHG-

8、44／CD細(xì)胞的凋亡率最高可達(dá)18.6％，明顯高于對照組(p<0.05)，其凋亡率也隨5-FC濃度的增加而遞增，呈現(xiàn)出劑量依賴性，并且與對照組相比，SHG-44／CD細(xì)胞周期各時相分布出現(xiàn)變化(p<0.05)。細(xì)胞周期分析顯示5-FC將SHG-44／CD細(xì)胞阻止于G1期，S期細(xì)胞減少。 結(jié)論：1．成功地建立了SHG-44惡性人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的CD／5-FC自殺基因系統(tǒng)。CD抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示SHG-44／CD細(xì)胞可穩(wěn)定、高效