人腦膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)分化基因譜的建立及相關(guān)基因的克隆.pdf

1、蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文人腦膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)分化基因譜的建立及相關(guān)基因的克隆姓名：孫立軍申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：杜子威黃強2001.4.1●八碴皎囊瘤鏹瞻誘導(dǎo)分化基因譜的建立及相關(guān)基函的克隆中文摘要常規(guī)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞。原代培養(yǎng)正常腦組織。在相差顯微鏡下用虹吸管吸取單個SHG44細胞，加滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，建立單克隆的膠質(zhì)瘤細胞株。2分化劑的篩選和分化程度鑒定。用MTT法檢測細胞增殖能力，常規(guī)Giemsa染色或H—E染色觀察細胞形態(tài)

2、，雙層軟瓊脂法檢測克隆形成率，流式細胞術(shù)測細胞周期動力學(xué)，免疫熒光測GFAP表達，劃痕法檢測細胞運動能力。3cDNAarray技術(shù)建立誘導(dǎo)分化基因譜。應(yīng)用BioRobotics公司的自動點膜儀制各cDNAarray膜(挑克隆，搖菌，抽質(zhì)粒，PCR，點膜)，抽提RNA，分離mRNA，用Q33PdATP標記成探針，與array膜雜交，結(jié)果用磷屏信號掃描分析，多點雜交驗證。4隨機引物差異展示技術(shù)克隆膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)分化相關(guān)基因。對苯丁酸鈉誘導(dǎo)前后的

3、膠質(zhì)瘤細胞抽提RNA，用隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，摻入Q32PdCTP，PAGE電泳，放射自顯影。回收并擴增差異條帶，SSCP純化，dotblot、Northernblot驗證，最后克隆差異基因片段，測序，生物信息學(xué)分析。【結(jié)果】1三個細胞株的特征和正常星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)：單細胞接種7天后，共得到25個克隆，命名為SHG一44一i至SHG一44—25。以其中的9號、17號、15號分別代表高、中、低分化，作重點觀察。在形態(tài)學(xué)、DNA含量