異甘草素對(duì)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究探討了不同濃度異甘草素對(duì)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化的影響及機(jī)制，旨在為異甘草素在治療人腦膠質(zhì)瘤的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用無血清培養(yǎng)基（含EGF、FGF、B27）以培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及Cyagen6孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板為載體培養(yǎng)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，通過CD133、Nestin聯(lián)合Bcl-2標(biāo)記進(jìn)行免疫熒光鑒定，并對(duì)比其倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)及干細(xì)胞球的形態(tài)、大小及數(shù)目，通過掃描電

2、鏡觀察干細(xì)胞形態(tài)。
　?。?）經(jīng)對(duì)比研究后，采用Cyagen6孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板為載體提取、純化和培養(yǎng)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基（含EGF、FGF、B27）（含與實(shí)驗(yàn)組等量的DMSO）為對(duì)照組，異甘草素(5～160μmol/L)為實(shí)驗(yàn)組，通過CCK-8法檢測(cè)作用12h、24h、48h及72h后的細(xì)胞活性，并觀察藥物作用至第7d膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球的形成情況。
　?。?）通過濃度和時(shí)間篩選后，以無血清D

3、MEM/F12培養(yǎng)基（含EGF、FGF、B27）（含與實(shí)驗(yàn)組等量的DMSO）為對(duì)照組，異甘草素（10～160μmol/L）為誘導(dǎo)組，DAPT(2.0μmol/L)為阻斷劑組，異甘草素+阻斷劑組(10～160μmol/L+2.0μmol/L DAPT)，通過免疫熒光染色觀察異甘草素作用24～72 h后細(xì)胞表面分化標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP）、β微管蛋白Ⅲ（β-TubulinⅢ）及干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白（Nestin）表達(dá)情況，通過Wes

4、tern blot檢測(cè)異甘草素作用72 h后Nestin、GFAP及β-TubulinⅢ的表達(dá)情況，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)異甘草素作用72 h后的細(xì)胞周期，通過Real-time PCR檢測(cè)作用72 h后Notch1、RBP-JK及Hes1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）SHG44膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮克隆球樣生長(zhǎng)，免疫熒光染色鑒定干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、Nestin表達(dá)呈陽性，且癌基因Bcl-2表達(dá)呈陽性；Cyag

5、en6孔懸浮培養(yǎng)板培養(yǎng)純化的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球較培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶純化的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球大且數(shù)目多（P＜0.05）；對(duì)于 Cyagen6孔懸浮培養(yǎng)板，隨著純化次數(shù)增加，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球更大、數(shù)目更多（P＜0.05），且呈更規(guī)則球形；倒置顯微鏡下膠質(zhì)瘤干細(xì)胞呈類圓形，掃描電鏡下呈球形，可見較長(zhǎng)梭形突起和較多細(xì)小突起，細(xì)胞間以觸角溝通。
　?。?）異甘草素在12-48 h，隨著濃度增加細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，且P＜0.05，72 h后隨著濃度增加細(xì)胞增

6、殖活性顯著降低，且P＜0.05；隔日加藥至第7 d時(shí)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球數(shù)目減少、直徑減小（與對(duì)照組比），且 P＜0.05，當(dāng)異甘草素濃度小于40μmol/L時(shí)，與160μmol/L相比，干細(xì)胞數(shù)目、直徑均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），當(dāng)異甘草素濃度大于40μmol/L時(shí)，與160μmol/L相比，干細(xì)胞數(shù)目、直徑均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　?。?）對(duì)照組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞無明顯分化，異甘草素組在24～48 h，隨濃度增

7、加分化細(xì)胞越多，且干細(xì)胞隨之減少，在72 h后，隨著濃度增加分化細(xì)胞及干細(xì)胞同時(shí)減少。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：異甘草素作用72 h后：與對(duì)照組比較，隨著異甘草素濃度的增加 Nestin蛋白表達(dá)量逐漸下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，10、40、160μmol/L組GFAP蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且40μmol/L組GFAP蛋白表達(dá)量較其他濃度組均較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，10、40、160μmol/L組β-TubulinⅢ蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且10μmol/L組β-TubulinⅢ蛋白表達(dá)量較其他濃度組均較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果：異甘草素作用72 h后，與對(duì)照組相比，隨著異甘草素濃度的增加 G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果：N

9、otch1通路阻斷劑作用后，與對(duì)照組比較，各異甘草素組和阻斷劑組Notch1、RBP-JK及Hes1基因表達(dá)均顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與異甘草素組比較，Notch1、RBP-JK及Hes1基因表達(dá)在異甘草素加DAPT組及阻斷劑組顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與阻斷劑組比較，Notch1、RBP-JK及 Hes1基因表達(dá)在異甘草素加DAPT組顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)