fmo同源蛋白基因的克隆及功能分析.pdf

1、黃素單加氧酶(flavin-containing monooxygenase,FMO)在哺乳動物中具有氧化含氮、硫、磷、硒和其他親核性外源化合物，代謝有毒和致癌物質(zhì)的功能。然而，在絲狀真菌中fmo的基因結(jié)構(gòu)及功能還不清楚。本實(shí)驗(yàn)室在前期構(gòu)建的殺蝗綠僵菌（Metarhizium acridum）侵染蝗蟲血淋巴的EST文庫中發(fā)現(xiàn)了與fmo同源的序列，將其命名為Mafmo。初步研究發(fā)現(xiàn)Mafmo基因可能影響M.acridum的毒力、生長發(fā)育和

2、產(chǎn)孢量。為了進(jìn)一步闡明Mafmo的基因結(jié)構(gòu)與功能，本研究以M.acridum為試驗(yàn)材料，克隆了Mafmo全長基因，構(gòu)建了Mafmo回復(fù)突變菌株，檢測了Mafmo在綠僵菌各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，分析了Mafmo在M.acridum生長發(fā)育及抗逆中的作用，還觀察了M.acridum侵染宿主東亞飛蝗（Locusta migratoria）后參與吞噬作用的血細(xì)胞類型。其結(jié)果對進(jìn)一步明確真菌的致病機(jī)制，以及篩選新的抗真菌藥物或高毒力殺蝗菌株均具有重

3、要的理論價(jià)值。論文研究結(jié)果及結(jié)論如下:
　　1.Mafmo基因克隆及回復(fù)突變菌株的構(gòu)建
　?。?）通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)，在已知Mafmo的EST序列（編號為CJY1439，長度為710bp）的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其3’末端和5’末端序列，采用PCR方法成功擴(kuò)增出Mafmo全長基因片段，其大小為4792bp。
　?。?）采用同源重組的

4、方法將Mafmo全長DNA片段插入載體pK2-sur-egfp，成功構(gòu)建了Mafmo回復(fù)突變載體pK2-sur-egfp-Mafmo；采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將pK2-sur-egfp-Mafmo轉(zhuǎn)入ΔMafmo菌株，獲得了穩(wěn)定的Mafmo+回復(fù)菌株。
　　2.Mafmo對M.acridum生長發(fā)育的影響
　　將綠僵菌野生型（Wildtype，WT）、綠僵菌的fmo敲除菌株（fmoknocked out strains inMe

5、tarhizium acridum，ΔMafmo）的孢子接種于1/4SDY固體培養(yǎng)基中，每2h取樣觀察比較綠僵菌的生長發(fā)育情況。觀察發(fā)現(xiàn)二者的孢子萌發(fā)率和菌絲生長情況都沒有差異，但二者產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成的時(shí)間不一樣，生長至14h時(shí)WT已經(jīng)有產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成，而ΔMafmo沒有出現(xiàn)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，該結(jié)果提示Mafmo可能參與了M.acridum的孢子形成。
　　3.Mafmo不影響M.acridum的萌發(fā)率、產(chǎn)孢量
　　通過測量統(tǒng)計(jì)WT、ΔM

6、afmo和綠僵菌的回復(fù)突變菌株（complementary transformant，CP）的產(chǎn)孢量和萌發(fā)率，將得到的數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行顯著性分析，得出結(jié)論，WT與ΔMafmo萌發(fā)率和產(chǎn)孢量均無顯著差異。
　　4.Mafmo影響M.acridum生物量的積累
　　通過稱量WT、ΔMafmo和CP菌株第3天的菌絲干重，發(fā)現(xiàn)ΔMafmo的生物積累量相比于比WT和CP增加50％，將得到的數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行顯著性分析，差異顯著，表明

7、Mafmo參與了M.acridum的代謝。
　　5.Mafmo影響M.acridum對熱激的敏感性
　　為了研究Mafmo的抗逆性，我們在紫照射和熱激條件下對孢子的萌發(fā)率進(jìn)行測定，其中，在紫外照射的條件下，WT與ΔMafmo萌發(fā)率的差異不顯著,但是在熱激的條件下，ΔMafmo萌發(fā)率比WT與顯著降低，該結(jié)果提示Mafmo參與M.acridum的抗熱激作用。
　　6.Mafmo表達(dá)水平分析
　　提取WT各個(gè)發(fā)育時(shí)期的