家蠶Apolipoprotein D基因克隆及功能分析.pdf

1、載脂蛋白D作為一種糖蛋白，主要存在于血液中的高密度脂蛋白（HDL），同時廣泛分布于各組織中。載脂蛋白 D主要作為脂類，固醇類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運體，同時還參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)，免疫系統(tǒng)反應(yīng)，抵抗外界壓力信號，改變運動能力以及參與一些神經(jīng)退行性疾病。載脂蛋白D廣泛存在于不同物種中，通過由八個反向平行的β折疊形成的L-型桶狀結(jié)構(gòu)與一些疏水性的小分子結(jié)合，運輸?shù)桨薪M織，參與調(diào)控組織的發(fā)育等生理功能。載脂蛋白 D在人類，小鼠，以及果蠅中有

2、著深入的研究，然而在家蠶中研究卻鮮有報道。作為一種重要的鱗翅目經(jīng)濟性昆蟲的家蠶，一直以來受到廣泛的關(guān)注。同時家蠶在發(fā)育過程中伴隨著巨大形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的變化。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們從家蠶蛹后期鑒定出了兩個具有 lipocalin結(jié)構(gòu)域的載脂蛋白 D（Apolipoprotein D）基因，在SilkDB編號為BGIBMGA002703，BGIBMGA002704。本研究主要通過生物信息學(xué)分析、基因克隆、原核表達、Western Blot

3、技術(shù)、免疫組化、熒光定量 PCR等方法鑒定到家蠶的兩個載脂蛋白 D蛋白，編號為BGIBMGA002703，BGIBMGA002704基因（ApoDⅠ和ApoDⅡ），并對其進行了克隆表達及抗體的制備研究，對其組織和時期表達特征進行探究及組織定位分析，同時對其功能進行了初步探究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過對家蠶蛹后期的蛻皮液和血液的雙向電泳分析，鑒定到了在SilkDB上編號為BGIBMGA002703，BGIBMGA002704

4、的兩個基因，基因定位于家蠶大造種的第五號染色體上，具體位置分別為 nscaf2529:4191766..4194594(+ strand)和nscaf2529:4202485..4205359(+strand)。芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR顯示，ApoDⅠ主要在家蠶的頭部和精巢表達，ApoDⅡ主要在家蠶的頭部和中部及后部絲腺表達?；蚪M結(jié)構(gòu)顯示它們都具有4個外顯子和3個內(nèi)含子，結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示ApoDⅠ具有一個 Lipocalin(PF00

5、061)結(jié)構(gòu)域，ApoDⅡ具有一個 Lipocalin_2(PF08212)結(jié)構(gòu)域。兩者氨基酸序列比對具有24.65％的相似性。對ApoDⅠ和ApoDⅡ基因進行序列分析發(fā)現(xiàn)，它們都具有信號肽序列。同時對兩個基因的編碼的蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，都能形成一個由八個反向平行的β折疊形成的L-型桶狀結(jié)構(gòu)。進化關(guān)系顯示家蠶的ApoDⅠ基因與美國白蛾的載脂蛋白D基因進化關(guān)系較近，ApoDⅡ基因與內(nèi)華達白蟻載脂蛋白D基因的進化關(guān)系較近。利用SilkD

6、B進行多序列比對，鑒定出家蠶中9個Lipocalin家族基因，共聚為三類，第一類主要在中腸特異表達，第二類主要在絲腺表達，第三類廣泛的在生殖腺，馬氏管，脂肪體，頭和血淋巴中表達。⑵通過對ApoDⅠ和ApoDⅡ基因的序列分析，設(shè)計不包含信號肽序列的表達引物。以蛹兩天的cDNA為模板進行PCR擴增，將獲得的片段插入到p28（pET-28a改造）載體上，測序成功后轉(zhuǎn)化到Transetta（DE3）表達菌株內(nèi)，發(fā)現(xiàn)ApoDⅠ和ApoDⅡ都以包涵

7、體的形式表達。純化 ApoDⅡ的包涵體，制備抗體。為獲得可溶性的蛋白，又構(gòu)建了 pET-SUMO-ApoDⅠ和 pET-SUMO-ApoDⅡ兩個原核表達載體，測序正確后，轉(zhuǎn)化入Transetta（DE3）表達菌株內(nèi)，在上清中獲得了SUMO-ApoDⅠ和SUMO-ApoDⅡ兩個重組蛋白。⑶利用RT-PCR對五齡第3天家蠶各組織檢測，發(fā)現(xiàn)ApoDⅠ基因主要在頭部和精巢表達，ApoDⅡ基因主要在家蠶頭部和絲腺表達。利用RT-PCR和Q-PCR

8、對五齡到蛹發(fā)育時期整蠶的核酸水平檢測，發(fā)現(xiàn)ApoDⅠ基因主要在蛹期表達，其中在化蛹第3天表達量達到最高。ApoDⅡ基因在蛹前期及蛹后期、蛾期有高量表達。利用Western blot技術(shù)對ApoDⅡ蛋白水平的表達檢測發(fā)現(xiàn)，ApoDⅡ蛋白主要存在家蠶五齡3天的頭部，脂肪體，生殖腺，以及中部和后部絲腺中。對家蠶五齡到蛹期的時期血液檢測發(fā)現(xiàn)，ApoDⅡ主要存在于上簇及蛹后期的血液中。對蛹期的頭和卵巢的檢測發(fā)現(xiàn)，在頭中ApoDⅡ主要在蛹6天高量表

9、達，卵巢中ApoDⅡ主要在蛹后期及蛾期有高表達。利用免疫熒光技術(shù)對載脂蛋白D（ApoDⅡ）進行組織定位，發(fā)現(xiàn)ApoDⅡ在家蠶五齡3天的精巢，卵巢，上簇時期的腦，化蛾當天的復(fù)眼中檢測到了信號。⑷選取UV和H2O2作為外界壓力信號，大腸桿菌和沙雷氏菌作為細菌侵染的菌株，處理家蠶，通過Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，ApoDⅠ和ApoDⅡ基因通過上調(diào)表達來響應(yīng)外界壓力信號，同時在細菌侵染實驗中，ApoDⅠ和 ApoDⅡ基因也以上調(diào)的方式來響應(yīng)外界細菌侵染