LRP16基因?qū)?xì)胞胰島素抵抗的影響及分子機(jī)制.pdf

1、目的：探討人白血病相關(guān)蛋白16（Leukemia Related Protein 16，LRP16）對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞、C2-C12成肌細(xì)胞、HepG2肝癌細(xì)胞胰島素抵抗的影響及可能的分子機(jī)制。
　　 方法：（1）利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及慢病毒介導(dǎo)的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)LRP16細(xì)胞系、抑制表達(dá)LRP16細(xì)胞系及對(duì)照細(xì)胞系。（2）將3T3-L1前脂肪細(xì)胞常規(guī)誘導(dǎo)成熟，

2、倒置顯微鏡觀察及油紅染色判斷過表達(dá)及抑制表達(dá)LRP16對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響；Q-PCR（Real-time Quantitative PCR）法檢測(cè)過表達(dá)及抑制表達(dá)LRP16對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化相關(guān)因子CAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CAAT/Enhancer Binding Protein alpha，C/EBPα）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferator activated rec

3、eptor gamma，PPARγ），以及腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha，TNFα）、白介素（Interleukin，IL）-6、抵抗素（Resistin）、脂聯(lián)素（Adiponectin）mRNA表達(dá)的影響。（3）2-deoxy-[3H]-D-glucose檢測(cè)過表達(dá)及抑制表達(dá)LRP16對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞、C2-C12成肌細(xì)胞、HepG2肝癌細(xì)胞胰島素刺激狀態(tài)下葡萄糖攝取率的影響；Weste

4、rn Blot法檢測(cè)上述細(xì)胞中過表達(dá)及抑制表達(dá)LRP16對(duì)胰島素受體底物（Insulin Receptor Substrate，IRS）-1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白pIRS-1（Ser307）、pIRS-1（Tyr）、PI3-K（p85）、pAkt（Ser473）、pAkt（Thr308）表達(dá)的影響。（4）將pCMX-PPARγ（pCMX-PPARα）、pGL3-PPRE、pcDNA-3.1、pcDNA-3.1-16、pRL-TK共轉(zhuǎn)染COS-

5、7細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)過氧化物酶體增生因子反應(yīng)元件（Peroxisome Proliferator Response Element，PPRE）相對(duì)熒光素酶活性以反映PPARγ及過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome Proliferator activated receptor alpha，PPARα）的轉(zhuǎn)錄活性；Western Blot法檢測(cè)過表達(dá)及抑制表達(dá)LRP16對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞，C2-C12成肌細(xì)

6、胞PPARγ、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Glucose Transporter，GLUT）-4表達(dá)的影響，及對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞PPARα、脂蛋白脂取Lipoprotein Lipase，LPL）蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了過表達(dá)及抑制表達(dá)LRP16的3T3-L1、C2-C12、HepG2細(xì)胞系與對(duì)照細(xì)胞系。（2）過表達(dá)LRP16的脂肪細(xì)胞脂滴大而少，分散而不均勻，呈明顯指環(huán)樣的脂滴較少，油紅O染色示570nmOD值低于

7、對(duì)照細(xì)胞；抑制表達(dá)LRP16的脂肪細(xì)胞脂滴小而多，密集而均勻，整個(gè)視野呈“油菜花樣”改變，油紅O染色示570nm OD值高于對(duì)照細(xì)胞.過表達(dá)LRP16的脂肪細(xì)胞C/EBPα、PPARγ及脂聯(lián)素mRNA表達(dá)低于對(duì)照細(xì)胞，TNFα、IL-6、抵抗素的mRNA表達(dá)高于對(duì)照細(xì)胞；抑制表達(dá)LRP16的脂肪細(xì)胞C/EBPα、PPARγ，及脂聯(lián)素mRNA表達(dá)高于對(duì)照細(xì)胞，TNFα，IL-6、抵抗素的mRNA表達(dá)低于對(duì)照細(xì)胞。（3）過表達(dá)LRP16抑制

8、3T3-L1脂肪細(xì)胞、C2-C12成肌細(xì)胞及HepG2肝癌細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖攝取，抑制表達(dá)LRP16則增加3T3-L1脂肪細(xì)胞、C2-C12成肌細(xì)胞及HepG2肝癌細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖攝取。過表達(dá)LRP16上調(diào)三種細(xì)胞pIRS-1（Ser307）蛋白的表達(dá)，下調(diào)pIRS-1（Tyr）、P13-K（p85）、pAkt（Ser473）、pAkt（Thr308）蛋白的表達(dá)，相反，抑制表達(dá)LRP16則下調(diào)三種細(xì)胞pIRS-1（Ser307

9、）蛋白的表達(dá)，上調(diào)pIRS-1（Tyr）、PI3-K（p85）、pAkt（Ser473）、pAkt（Thr308）蛋白的表達(dá)。（4）LRP16劑量依賴性的降低PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)pcDNA3.1-16量為0.4μg時(shí)，pGL3-PPRE的相對(duì)熒光素酶活性降低為對(duì)照組的43％（P<0.01），當(dāng)pcDNA3.1-16量為0.5μg時(shí)，pGL3-PPRE的相對(duì)熒光素酶活性降低為對(duì)照組的27％（P<0.01）；LRP16劑量依賴性的降低P

10、PARα的轉(zhuǎn)錄活性：當(dāng)pcDNA3.1-16量為0.4μg時(shí)，pGL3-PPRE的相對(duì)熒光素酶活性降低為對(duì)照組的38％（P<0.01），當(dāng)pcDNA3.1-16量為0.5μg時(shí)，pGL3-PPRE的相對(duì)熒光素酶活性降低為對(duì)照組的35％（P<0.01）。過表達(dá)LRP16下調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞、C2-C12成肌細(xì)胞PPARγ、GLUT-4蛋白的表達(dá)，抑制表達(dá)LRP16則上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARγ、GLUT-4蛋白的表達(dá)；過表達(dá)LR