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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究分為三部分:
第一部分:小檗堿對(duì)NIT-1細(xì)胞胰島素分泌及葡萄糖激酶活性的影響
目的:
觀察小檗堿對(duì)NIT-1細(xì)胞在不同濃度葡萄糖刺激下胰島素分泌的影響,檢測(cè)小檗堿對(duì)葡萄糖激酶活性及表達(dá)的影響,以初步闡明小檗堿在體外促進(jìn)胰島素分泌的可能機(jī)制。
方法:
將NIT-1細(xì)胞在含不同濃度葡萄糖(高濃度 (16.5 mM),低濃度 (5.5 mM))的培養(yǎng)基中培養(yǎng),并用不
2、同濃度小檗堿干預(yù),選用生物素作為陽(yáng)性對(duì)照藥。用放免法檢測(cè)胰島素濃度,液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)葡萄糖利用,生物發(fā)光技術(shù)檢測(cè)ATP含量,酶法分析檢測(cè)葡萄糖激酶活性,Western blot檢測(cè)葡萄糖激酶(GK)和葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(GKRP)在蛋白水平表達(dá)的變化,并用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)葡萄糖激酶在細(xì)胞核內(nèi)外轉(zhuǎn)移。
結(jié)果:
在高濃度葡萄糖刺激下,與空白對(duì)照組相比較,小檗堿能使葡萄糖刺激下NIT-1細(xì)胞胰島素分泌水平升高,葡
3、萄糖利用增強(qiáng),ATP含量增加,GK活性提高;同時(shí),小檗堿能使細(xì)胞內(nèi)GK表達(dá)增加而GKRP表達(dá)減少,還能使GK在細(xì)胞漿內(nèi)的表達(dá)增加,小檗堿的這些生物學(xué)效應(yīng)與已被證實(shí)的葡萄激酶激活劑生物素相比較無(wú)顯著差異。在低濃度葡萄糖刺激,小檗堿和生物素的上述活性與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。
結(jié)論:
小檗堿能促進(jìn)NIT-1細(xì)胞在高濃度葡萄糖刺激下的胰島素分泌;這種效應(yīng)的可能機(jī)制是:小檗堿作為GK激活劑,使GK表達(dá)增強(qiáng)而GKRP
4、表達(dá)減少,促進(jìn)GK向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)運(yùn),從而使GK活性增強(qiáng),最終使胰島素分泌增強(qiáng)。
第二部分:小檗堿改善高糖高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠靶組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究
目的:
建立高糖高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型,觀察小檗堿對(duì)2型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響,同時(shí)檢測(cè)肝臟和脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,以探討小檗堿改善胰島素抵抗、治療2型糖尿病的分
5、子機(jī)制。
方法:
采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)加尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,15mg/kg)的方法建立2型糖尿病大鼠模型,將造模動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、小檗堿組、4-苯基丁酸組,另設(shè)正常對(duì)照組。藥物干預(yù)治療6周后,進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)并檢測(cè)各組動(dòng)物空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)BG)、空腹血清
6、胰島素(fasting serum insulin,F(xiàn)INS)、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白值,并用Western blot檢測(cè)各組大鼠肝臟和脂肪組織中總JNK和c-Jun-磷酸化水平、總IRS-1和AKT蛋白及磷酸化的水平,用RT-PCR檢測(cè)GRP78和ORP150基因轉(zhuǎn)錄水平。
結(jié)果:
與模型組比較,小檗堿能顯著改善大鼠OGTT,降低FBG,升高FIN,使總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白
7、顯著降低,而高密度脂蛋白升高;同時(shí),大鼠肝臟和脂肪組織中JNK活性降低,而GRP78和ORP150基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),小檗堿還能使外周組織胰島素刺激后IRS-1 Ser307 磷酸化水平下調(diào),而AKT Ser473 磷酸化水平升高;小檗堿的上述效應(yīng)與已被證實(shí)的具有改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的4-苯基丁酸治療組相比無(wú)顯著差異。
結(jié)論:
小檗堿通過減緩2型糖尿病大鼠肝臟和脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并改善胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而發(fā)揮降糖降
8、脂的生物學(xué)活性。
第三部分:小檗堿對(duì)衣霉素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
目的:
建立衣霉素誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的細(xì)胞模型,研究小檗堿對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖代謝的效應(yīng),并檢測(cè)小檗堿對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物JNK活性和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的影響,探討小檗堿改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。
方法:
分別以0.5μg/ml或2.0μg/ml衣霉素作用于Hep G2肝細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生
9、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并予以小檗堿預(yù)處理,同時(shí)選用4-苯基丁酸作為陽(yáng)性對(duì)照藥,分別用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖消耗和葡萄糖合成水平,Western blot檢測(cè)JNK和c-Jun-磷酸化表達(dá)水平,總IRS-1和AKT蛋白表達(dá)及其磷酸化水平;并用real time-PCR檢測(cè)小檗堿對(duì)Hep G2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下GRP78和ORP150基因表達(dá)的影響。
結(jié)果:
與模型組比較,小檗堿能顯著改善Hep G2細(xì)胞胰島素
10、刺激下葡萄糖消耗,抑制肝細(xì)胞葡萄糖合成,并使JNK活性降低、而使GRP78和ORP150基因表達(dá)顯著降低,同時(shí),小檗堿能使IRS-1 Ser307 磷酸化水平減少,而使AKT Ser473 磷酸化水平增加;小檗堿的上述生物學(xué)效應(yīng)與4-苯基丁酸治療組相比無(wú)顯著差異。
結(jié)論:
小檗堿可以明顯改善衣霉素誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素抵抗,其分子機(jī)制可能與小檗堿阻斷JNK的激活,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶分子GRP
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