小檗堿促進(jìn)胰島素分泌改善胰島素抵抗的分子機(jī)制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：小檗堿對(duì)NIT-1細(xì)胞胰島素分泌及葡萄糖激酶活性的影響
　　 目的：
　　 觀察小檗堿對(duì)NIT-1細(xì)胞在不同濃度葡萄糖刺激下胰島素分泌的影響，檢測(cè)小檗堿對(duì)葡萄糖激酶活性及表達(dá)的影響，以初步闡明小檗堿在體外促進(jìn)胰島素分泌的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 將NIT-1細(xì)胞在含不同濃度葡萄糖（高濃度 (16.5 mM)，低濃度 (5.5 mM)）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用不

2、同濃度小檗堿干預(yù)，選用生物素作為陽(yáng)性對(duì)照藥。用放免法檢測(cè)胰島素濃度，液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)葡萄糖利用，生物發(fā)光技術(shù)檢測(cè)ATP含量，酶法分析檢測(cè)葡萄糖激酶活性，Western blot檢測(cè)葡萄糖激酶（GK）和葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(GKRP)在蛋白水平表達(dá)的變化，并用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)葡萄糖激酶在細(xì)胞核內(nèi)外轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)果：
　　 在高濃度葡萄糖刺激下，與空白對(duì)照組相比較，小檗堿能使葡萄糖刺激下NIT-1細(xì)胞胰島素分泌水平升高，葡

3、萄糖利用增強(qiáng)，ATP含量增加，GK活性提高；同時(shí)，小檗堿能使細(xì)胞內(nèi)GK表達(dá)增加而GKRP表達(dá)減少，還能使GK在細(xì)胞漿內(nèi)的表達(dá)增加，小檗堿的這些生物學(xué)效應(yīng)與已被證實(shí)的葡萄激酶激活劑生物素相比較無(wú)顯著差異。在低濃度葡萄糖刺激，小檗堿和生物素的上述活性與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 小檗堿能促進(jìn)NIT-1細(xì)胞在高濃度葡萄糖刺激下的胰島素分泌；這種效應(yīng)的可能機(jī)制是：小檗堿作為GK激活劑，使GK表達(dá)增強(qiáng)而GKRP

4、表達(dá)減少，促進(jìn)GK向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使GK活性增強(qiáng)，最終使胰島素分泌增強(qiáng)。
　　 第二部分：小檗堿改善高糖高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠靶組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究
　　 目的：
　　 建立高糖高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型，觀察小檗堿對(duì)2型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響，同時(shí)檢測(cè)肝臟和脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以探討小檗堿改善胰島素抵抗、治療2型糖尿病的分

5、子機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)加尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，15mg/kg）的方法建立2型糖尿病大鼠模型，將造模動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、小檗堿組、4-苯基丁酸組，另設(shè)正常對(duì)照組。藥物干預(yù)治療6周后，進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）并檢測(cè)各組動(dòng)物空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、空腹血清

6、胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白值，并用Western blot檢測(cè)各組大鼠肝臟和脂肪組織中總JNK和c-Jun-磷酸化水平、總IRS-1和AKT蛋白及磷酸化的水平，用RT-PCR檢測(cè)GRP78和ORP150基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　 結(jié)果：
　　 與模型組比較，小檗堿能顯著改善大鼠OGTT，降低FBG，升高FIN，使總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白

7、顯著降低，而高密度脂蛋白升高；同時(shí)，大鼠肝臟和脂肪組織中JNK活性降低，而GRP78和ORP150基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，小檗堿還能使外周組織胰島素刺激后IRS-1 Ser307 磷酸化水平下調(diào)，而AKT Ser473 磷酸化水平升高；小檗堿的上述效應(yīng)與已被證實(shí)的具有改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的4-苯基丁酸治療組相比無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 小檗堿通過減緩2型糖尿病大鼠肝臟和脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并改善胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而發(fā)揮降糖降

8、脂的生物學(xué)活性。
　　 第三部分：小檗堿對(duì)衣霉素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
　　 目的：
　　 建立衣霉素誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的細(xì)胞模型，研究小檗堿對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖代謝的效應(yīng)，并檢測(cè)小檗堿對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物JNK活性和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的影響，探討小檗堿改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 分別以0.5μg/ml或2.0μg/ml衣霉素作用于Hep G2肝細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生

9、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并予以小檗堿預(yù)處理，同時(shí)選用4-苯基丁酸作為陽(yáng)性對(duì)照藥，分別用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖消耗和葡萄糖合成水平，Western blot檢測(cè)JNK和c-Jun-磷酸化表達(dá)水平，總IRS-1和AKT蛋白表達(dá)及其磷酸化水平；并用real time-PCR檢測(cè)小檗堿對(duì)Hep G2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下GRP78和ORP150基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 與模型組比較，小檗堿能顯著改善Hep G2細(xì)胞胰島素

10、刺激下葡萄糖消耗，抑制肝細(xì)胞葡萄糖合成，并使JNK活性降低、而使GRP78和ORP150基因表達(dá)顯著降低，同時(shí)，小檗堿能使IRS-1 Ser307 磷酸化水平減少，而使AKT Ser473 磷酸化水平增加；小檗堿的上述生物學(xué)效應(yīng)與4-苯基丁酸治療組相比無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 小檗堿可以明顯改善衣霉素誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素抵抗，其分子機(jī)制可能與小檗堿阻斷JNK的激活，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶分子GRP