草魚(yú)IFN-γrel的重組表達(dá)﹑純化和免疫學(xué)功能研究.pdf

1、CD4+T淋巴細(xì)胞根據(jù)標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子和分泌的細(xì)胞因子不同，可分為T(mén)h1，Th2，Th17和Treg四個(gè)細(xì)胞亞群。Th1細(xì)胞亞群中標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子為T(mén)-bet，分泌的主要細(xì)胞因子是IFN-γ和IL-12。DC細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ可以上調(diào)CD4+ T細(xì)胞中T-bet的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而促進(jìn)CD4+ T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，同時(shí)T-bet能結(jié)合在IFN-γ的啟動(dòng)子上增強(qiáng)Th1細(xì)胞自身進(jìn)一步產(chǎn)生IFN-γ。然而在硬骨魚(yú)中存在兩個(gè)II型干擾素基因，IF

2、N-γ2和IFN-γrel（又名IFN-γ1），其中后者的免疫功能地位并不清楚。為了清楚草魚(yú)IFN-γrel的功能特性，本課題將草魚(yú)的IFN-γrel成熟肽編碼序列克隆至原核表達(dá)載體 pET30a(+)，通過(guò)多次優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)體系，大量目的蛋白出現(xiàn)在包涵體中，進(jìn)而嘗試透析復(fù)性，稀釋復(fù)性等多種方法以期獲得具有生物學(xué)活性的重組蛋白，但經(jīng)凝膠層析或親和層析純化得到純度較高的蛋白后，Real-time PCR結(jié)果分析顯示重組蛋白無(wú)法調(diào)節(jié)下游基因的

3、表達(dá)。故將IFN-γrel編碼區(qū)克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-his，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HEK293細(xì)胞48小時(shí)后，收集并濃縮培養(yǎng)基，Western blotting分析表明IFN-γrel蛋白表達(dá)成功并分泌到胞外，Real-time PCR結(jié)果分析顯示真核表達(dá)的蛋白能夠上調(diào)草魚(yú)頭腎白細(xì)胞中IL-8的基因表達(dá)，證明重組蛋白具有生物學(xué)活性。鑒于Th1細(xì)胞亞群中IFN-γ和標(biāo)志轉(zhuǎn)錄因子T-bet的密切關(guān)系，草魚(yú)T-bet被克隆和鑒定，