導(dǎo)向性IFN-α2a-α-MSH基因的克隆、融合蛋白的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的測定.pdf

1、目的：IFN-α2a是一種具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性等多種生物功能的細(xì)胞因子，已被FDA批準(zhǔn)用于多種病毒性疾病和惡性腫瘤的治療。但I(xiàn)FN-α2a在臨床治療中需大劑量長期給藥，并且常常引發(fā)明顯的毒副作用，嚴(yán)重制約著IFN-α2a的臨床應(yīng)用。 Α-MSH（SYSMEHFRWGKPV）是一種由多種細(xì)胞分泌的含13肽激素，是一種天然存在的多肽，可特異性的與黑素細(xì)胞及惡性黑色素瘤細(xì)胞表面的MC-1R結(jié)合，促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞的凋亡，

2、并可通過皮膚基底膜的重建抑制皮膚惡性黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。研究表明所有黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞都表達(dá)α-MSH受體MC-1R，且黑素瘤細(xì)胞表達(dá)MC-1R上調(diào)，人黑素瘤細(xì)胞表面MC-1R密度為900-5700個(gè)結(jié)合位點(diǎn)/每細(xì)胞，而正常狀態(tài)下人表皮黑素細(xì)胞上MC-1R不超過100個(gè)結(jié)合位點(diǎn)/每細(xì)胞。本課題擬利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建導(dǎo)向性IFN-α2a-α-MSH融合基因表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)，制備一種治療惡性黑色素瘤的靶向制劑。 方法：將

3、本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pET-22b(+)IFN-α2a-NGR用BamH I和Sal I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將得到的大片段與設(shè)計(jì)的α-MSH多肽片段退火后的產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-22b(+)IFN-α2a-α-MSH，將序列鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Rosetta-gamiTM2(DE3)大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE及Western Blot鑒定，疏水作用層析純化蛋白。 建立小

4、鼠惡性黑色素瘤模型，用得到的IFN-α2a-α-MSH蛋白對惡性黑色素瘤小鼠進(jìn)行治療，觀察腫瘤體積變化，計(jì)算抑瘤率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了IFN-α2a-α-MSH的穩(wěn)定、高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，采用超聲裂菌的方法，用疏水作用層析技術(shù)獲得較高純度的重組蛋白。抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IFN-α2a-α-MSH的抑瘤率明顯高于IFN-α2a和對照組。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pET-22b(+)IFN-