RBV聯(lián)合IFN-β治療HCV和miRNAs表達關(guān)系的體外研究.pdf

1、背景與目的
　　 盡管已研究數(shù)十年,丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)持續(xù)感染仍然是全球一個主要的健康問題。肝特異性微小核糖核酸122(miRNA-122,miR-122)在體外和體內(nèi)均可促進HCV復制和翻譯,提示miR-122與HCV發(fā)病機制有關(guān)。然而對干擾素(interferon,IFN)能否通,過調(diào)節(jié)肝細胞miR-122或其他miRNAs(包括miR-196b,miR-296,miR-351,miR

2、-431和miR-448)來抑制HCV存在爭議。此外,臨床上利巴韋林(ribavirin,RBV)能明顯提高IFN的抗HCV療效,但機制仍未清楚。由于RBV能抑制細胞增殖、減少GTP池和干擾核酸代謝,因此RBV有可能影響細胞miRNAs的表達,及隨后的協(xié)同IFN抗HCV。在這項體外實驗中,主要是研究IFNβ聯(lián)合RBV治療HCV與肝細胞miR-122或其他miRNAs表達的關(guān)系,探討這兩種藥物新的可能作用機制,對目前HCV的抗病毒治療和療

3、效抵抗的宿主機制均有重要的指導意義。
　　 方法：
　　 1.莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR對Huh7細胞miRNAs的檢測,目的是建立一種簡便檢測人肝癌細胞株Huh7細胞miRNAs的實時定量PCR方法:提取Huh7細胞總RNA,通過miRNA芯片檢測出3個分別代表高、中、低拷貝的miR-122、24、146a,并用磷32標記的Northern印跡證實。然后分別采用poly(A)加尾和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR方法

4、檢測上述3個miRNA。用Quantity One軟件和7500系統(tǒng)軟件進行分析。
　　 2.IFNβ聯(lián)合RBV治療對Huh7細胞miR-122和其他miRNA的表達影響:Huh7細胞分別經(jīng)過RBV(12.5μM,25μM or50μM)處理3d、IFNβ(10 U/ml,100 U/ml,or1000 U/m1)處理2h～16h,單用或聯(lián)合用。噻唑蘭(MTT)法檢測其生長曲線,RT-PCR法檢測干擾素誘導基因54(ISG54)

5、表達,莖環(huán)結(jié)構(gòu)實時PCR和地高辛標記的Northern印跡檢測miR-122和miR-196b表達變化。miRNA芯片檢測miRNA表達譜變化。數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗。
　　 3.IFNβ聯(lián)合RBV治療對含有HCV亞復制子的Huh7細胞miR-122和其他miRNA的表達影響:復制子細胞分別經(jīng)過RBV(12.5μM,251μM or50μM)處理3d、IFNβ(10 U/ml,100 U/ml,or100

6、0 U/ml)處理2h～16h,單用或聯(lián)合用。噻唑蘭(MTT)法檢測其生長曲線,RT-PCR法檢測干擾素誘導基因54(ISG54)和HCV RNA表達,莖環(huán)結(jié)構(gòu)實時PCR和地高辛標記的Northern印跡檢測miR-122和miR-196b表達變化。miRNA芯片檢測miRNA表達譜變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.Huh7細胞芯片miR-122、24、146a的信號強度分別為2201.49、410.20、4.70,磷32

7、標記的Northern印跡證實相對表達量分別為0.0383、0.0249、0.0001。poly(A)加尾逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR方法只能檢測出miR-122,而莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR方法對miR-122、24、146a均能檢測出,其相對于U6平均dCt值分別為2.5、5.8、12.1,與miRNA芯片和Northern印跡結(jié)果一致。
　　 2.IFNβ聯(lián)合RBV治療對Huh7細胞miR-122和其他miRNA的表達影響:R

8、BV能以劑量依賴方式分別抑制Huh7生長,IFNβ能以劑量和時間依賴方式誘導細胞ISG54和miR-196b表達,聯(lián)合治療沒有協(xié)同效果。IFNβ和RBV均能輕微抑制細胞miR-122水平,聯(lián)合治療有輕微協(xié)同效果。miRNA芯片檢測IFNβ和RBV治療能導致Huh7細胞138種miRNAs輕微變化。
　　 3.IFNβ聯(lián)合RBV治療對含有HCV亞復制子的Huh7細胞miR-122和其他miRNA的表達影響:同樣,RBV能以劑量依賴

9、方式分別抑制細胞生長,IFNβ能以劑量和時間依賴方式誘導細胞ISG54和miR-196b表達,聯(lián)合治療沒有協(xié)同效果。IFNβ和RBV均能輕微抑制細胞miR-122水平,聯(lián)合治療無明顯協(xié)同效果。關(guān)鍵是,IFNβ和RBV治療能協(xié)同抑制含有HCV亞復制子的Huh7細胞HCV RNA水平。同樣,miRNA芯片檢測IFNβ和RBV治療僅能導致含有HCV亞復制子的Huh7細胞16種miRNAs輕微變化,提示生物學作用有限。
　　 結(jié)論：

10、r>　　 1.應用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR方法能夠特異、敏感地檢測出Huh7細胞高(miR-122)、中(miR-24)、低(miR-146a)拷貝的miRNAs,而poly(A)加尾逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR方法只能檢測出高(miR-122)拷貝的miRNA。
　　 2.IFNβ可上調(diào)含和不含HCV亞復制子的Huh7細胞ISG54,RBV可抑制細胞增殖,聯(lián)合用可協(xié)同下調(diào)HCV RNA。然而RBV和IFNβ治療僅引起肝特異性m