豬IFN-γ基因的表達(dá)及抗體制備和雞Ii鏈功能的研究.pdf

1、干擾素(IFN)是一類(lèi)具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用的細(xì)胞因子,能增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能、促進(jìn)B細(xì)胞分化、MHC I和、MHC II類(lèi)分子的表達(dá)以及活化巨噬細(xì)胞。為研究豬γ干擾素(poIFN-γ)的生物學(xué)活性及其在機(jī)體免疫應(yīng)答中的作用機(jī)理,本研究進(jìn)行了該基因的克隆、表達(dá)和多克隆抗體的制備；用兩對(duì)引物通過(guò)PCR從PMDl8-T/Ii P31質(zhì)粒中擴(kuò)增出雞Ii的P31基因,將該基因分別插入真核表達(dá)載體pEGFP-N1和pEGFP-C1中,構(gòu)建成

2、pEGFP-N1-P31和pEGFP-C1-P31質(zhì)粒。 ⑴應(yīng)用RT-PCR方法通過(guò)一對(duì)自行設(shè)計(jì)的引物從豬脾臟淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增了豬γ干擾素基因片段,經(jīng)單酶切鑒定,與GenBank中登錄的豬IFN-γ基因序列含有相同的單酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到pGEX-4T-1和pET-32a載體,經(jīng)菌液PCR篩選出陽(yáng)性重組克隆后進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果表明,克隆獲得的IFN-γ基因全長(zhǎng)為516個(gè)堿基,ORF為501個(gè)堿基,編碼166個(gè)氨

3、基酸,分子質(zhì)量約為17kD。此基因與GenBank上發(fā)表的豬IFN-γ基因的核苷酸同源性為100％,并且在氨基酸水平上也完全一致。 ⑵將重組質(zhì)粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),得到高效表達(dá)。所表達(dá)的融合蛋白主要是以不溶性的包涵體形式存在,分子量約43.0kD和35.0kD,與理論推算值相符。通過(guò)優(yōu)化原核表達(dá)條件,確定了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-poIFN-γ和pET-poI

4、FN-γ的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度后,對(duì)含有pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ質(zhì)粒的BL21菌進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá),獲得了較高濃度的GST-IFN-γ和His-IFN-γ包涵體蛋白,用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解,提取了大量的可溶性GST-IFN-γ和His-IFN-γ原核融合表達(dá)蛋白。 ⑶利用上述純化的GST-IFN-γ融合蛋白作為抗原免疫小鼠制備鼠抗豬IFN-γ多克隆抗體。在對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行復(fù)性和

5、親和層析純化之后,用其免疫小鼠,制備了針對(duì)該蛋白的鼠多克隆抗體。ELISA和Western Blotting結(jié)果說(shuō)明GST-IFN-γ融合蛋白可誘導(dǎo)出針對(duì)poIFN-γ蛋白的特異性抗體。 ⑷應(yīng)用大引物PCR突變法,將雞Ii鏈的第8位和第18位的Leu分別突變?yōu)锳la后,突變體的GFP都仍能定位于內(nèi)體。進(jìn)一步將雞Ii鏈的第8位和第18位的Leu均突變?yōu)锳la后,雞Ii鏈的內(nèi)體定位功能消失,這表明雞Ii鏈胞漿區(qū)存在Leu 8/Ile