重組犬IFN-γ在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)及犬IFN-γ腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)主要由活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，絲裂原以及抗原特異性刺激T淋巴細(xì)胞克隆也可產(chǎn)生。它除了具有抗病毒、抗腫瘤活性外，還起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，如活化巨噬細(xì)胞、提高MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子的表達(dá)、促進抗原提呈，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化等，在機體對腫瘤及多種胞內(nèi)病原感染的免疫控制和免疫病理中起著重要的作用。由于IFN-γ對機體免疫系統(tǒng)具有極大的調(diào)節(jié)作用，是機體發(fā)揮免疫功能，清除體內(nèi)病原體不可缺少

2、的成分。因此IFN-γ既可以作為藥劑用于感染性疾病或腫瘤等的治療，又可以作為免疫佐劑，增強疫苗的免疫效果。 為了建立一套犬IFN-γ(canine interferon-γ，CaIFN-γ)在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)的方法，本研究用伴刀豆球蛋白A(conA)刺激犬脾細(xì)胞，通過RT-PCR方法從犬脾細(xì)胞中擴增得到犬IFN-γ基因。分離純化擴增片段，并將其克隆到pcDNA3.1A載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過酶切鑒定

3、篩選出陽性克隆，測序鑒定。構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1A-CalFN-γ經(jīng)磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進行表達(dá)。結(jié)果表明，克隆的犬IFN-γcDNA基因與GenBank上發(fā)表的序列一致，同源性100％。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot方法檢測，證明克隆的犬IFN吖基因能夠在HEK293T細(xì)胞中進行表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物能夠分泌到細(xì)胞外。犬IFN-γ重組表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建與真核表達(dá)，為以后進行犬IFN-γ活性分析和生物學(xué)功能的研究

4、奠定了基礎(chǔ)。 本研究在犬IFN-γ基因進行真核細(xì)胞表達(dá)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了犬IFN-γ基因的重組腺病毒載體。采用體外連接的重組腺病毒方法，在表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1A-CalFN-γ-STOP上通過Kpn I和Adpa I雙酶切獲得包含終止密碼子的CalFN-γ片段，重組到穿梭質(zhì)粒pShuttle3/gfp)的人巨細(xì)胞病毒啟動子(hCMV)和SV40多聚腺苷酸尾(polyA)之間的多克隆位點內(nèi)，得到重組穿梭質(zhì)粒pShuttle3/g

5、fp-CalFN- γ，進行酶切鑒定。以PI-Sce I和1-Ceu I雙酶切重組穿梭質(zhì)粒，獲得含有CMV-CaWN-γ的表達(dá)盒，與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒Adeno-X Viral DNA連接，經(jīng)Swa I酶切去除Adeno-X Viral DNA自身環(huán)化質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，重組成pAdeno-CalFN-γ腺病毒質(zhì)粒，鑒定成功后再經(jīng)Pac I酶切線性化并暴露其兩端的反向重復(fù)序列(ITTRs)，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，待出