草魚TNF-α和IFNγ2的克隆鑒定、重組表達(dá)及生物學(xué)功能的研究.pdf

1、細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞及其它類型細(xì)胞合成或分泌的高活性、多功能的小分子蛋白質(zhì)物質(zhì)，能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理功能。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和干擾素γ(Interferonγ,IFNγ)在免疫功能和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，均為多效應(yīng)的細(xì)胞因子。為了研究草魚TNF-α和IFNγ的分子結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，本課題克隆獲得草魚TNF-α和IFNγ2的cDNA全長序列，然后分別將其成熟肽克隆至pET30a

2、(+)載體，構(gòu)建BL21(DE3)-pET30a(+)-TNF-α和BL21(DE3)-pET30a(+)-IFNγ2原核表達(dá)系統(tǒng)。通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，獲得較高產(chǎn)量的可溶性重組蛋白，經(jīng)過鎳螯合柱親和層析后進(jìn)行分子篩層析，得到高純度的重組草魚TNF-α蛋白(rgcTNF-α)和重組草魚IFNγ2蛋白(rgcIFNγ2)。利用重組蛋白純品刺激草魚頭腎白細(xì)胞，Real-time PCR分析顯示rgcTNF-α能明顯誘導(dǎo)NF-κB信號通路中相

3、關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平，且western blot分析顯示rgcTNF-α能調(diào)節(jié)IκBα磷酸化狀態(tài)，而rgcIFNγ2則能有效促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的IL-1β mRNA表達(dá)水平，從而對此兩種重組蛋白功能活性進(jìn)行初步探討。
　　本課題從分子克隆、序列分析、重組表達(dá)、蛋白純化及活性鑒定等不同層面研究草魚TNF-α和IFNγ2的分子結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，比較系統(tǒng)地闡明它們在魚類免疫系統(tǒng)中的功能地位，不僅為深入研究它們在免疫進(jìn)化過程中的結(jié)構(gòu)和功能演