平邑甜茶根系MhEXP基因的克隆、表達(dá)及其生理功能的初步研究.pdf

1、擴(kuò)展蛋白(Expansin)能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的膨脹來控制植物細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)而可以調(diào)節(jié)根系的生長(zhǎng)，平邑甜茶(Malus hupehensis(Pamp)Rehd．var pin2yiensis Jiang)是蘋果和觀賞海棠的優(yōu)良砧木之一，而根系是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施的主要作用中心。為從分子水平揭示根系生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理，并為運(yùn)用生物技術(shù)調(diào)控根系生長(zhǎng)提供理論依據(jù)，本試驗(yàn)以平邑甜茶為試材，從其白色新根中分離到兩個(gè)擴(kuò)展蛋白同源基因，對(duì)它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分

2、析，并研究了這兩個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)及其與內(nèi)源激素和ATPase的關(guān)系，還構(gòu)建了pBI121-MhEXP2載體，獲得了MhEXP2原核表達(dá)蛋白。主要結(jié)果如下： 1．根據(jù)已知擴(kuò)展蛋白基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RF-PCR結(jié)合RACE技術(shù)獲得了兩個(gè)擴(kuò)展蛋白基因，分別命名為．MhEXP1和MhEXP2。GenBank注冊(cè)號(hào)分別為DQ538346和DQ993160。 2．序列分析表明，MhEXP1cDNA全長(zhǎng)1111bp，含有771

3、 bp的完整開放閱讀框，編碼257個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別為27.8kD和8.9。MhEXP2 cDNA全長(zhǎng)1320bp，含有762bp的完整開放閱讀框，編碼254個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別為26.8kD和9.4。MhEXP1和MhEXP2具有擴(kuò)展蛋白的典型結(jié)構(gòu)，即氨基酸序列N端有8個(gè)半胱氨酸殘基，1個(gè)組氨酸(His-Phe-Asp，HFD)域，C末端存在4個(gè)保守的色氨酸殘基。同源分析發(fā)現(xiàn)，二者氨基酸水平上的同源性為56.

4、98％。聚類分析發(fā)現(xiàn)，MhEXP1蛋白與α-EXP的第V亞家族親緣關(guān)系最近；MhEXP2蛋白與α-EXP的第Ⅰ亞家族親緣關(guān)系最近。結(jié)果表明，我們已經(jīng)分離到平邑甜茶根系擴(kuò)展蛋白基因。通過PlantCARE分析發(fā)現(xiàn)，MhEXP1和MhEXP2都具有生長(zhǎng)素順式作用原件，MhEXP2還有茉莉酸誘導(dǎo)(TGACG-motif)、低溫誘導(dǎo)(LTR)、熱脅迫誘導(dǎo)(HSE)等順式作用原件。因此，我們推測(cè)MhEXP2基因除了參入了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還可能與植

5、物與逆境的適應(yīng)有關(guān)。 3．Northem雜交分析平邑甜茶擴(kuò)展蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MhEXP1基因在平邑甜茶根系中特異表達(dá)，且其表達(dá)受IBA的調(diào)控。MhEXP2基因在平邑甜茶根和葉中都表達(dá)，它的表達(dá)也受IBA的調(diào)控。 4．通過對(duì)Ca<'2+>-ATPase活性和H<'+>-ATPase活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Ca<'2+>-ATPase活性早于H<'+>-ATPase活性先達(dá)到高峰，因此推測(cè)作為第二信使的Ca<'2+>可能激活了H<'+>-AT

6、Pase活性。而H<'+>-ATPase活性在擴(kuò)展蛋白前達(dá)到高峰，為擴(kuò)展蛋白提供了一個(gè)適宜酸性的環(huán)境，這有利于擴(kuò)展蛋白的功能的發(fā)揮。 5．通過對(duì)平邑甜茶根系內(nèi)源激素的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)擴(kuò)展蛋白的表達(dá)不僅僅受生長(zhǎng)素的絕對(duì)含量所調(diào)控，而是受IAA/ABA的相對(duì)含量所調(diào)控，6．構(gòu)建了pBI121-MhEXP2正義表達(dá)載體，并對(duì)煙草進(jìn)行了農(nóng)桿菌侵染。將MhEXP2編碼區(qū)正向克隆到原核表達(dá)載體pET30a-c(+)，并通過原核表達(dá)獲得了MhE