平邑甜茶IPT3基因的克隆及其對(duì)氮信號(hào)響應(yīng)特性.pdf

1、在已研究不同形態(tài)氮養(yǎng)分對(duì)果樹葉片生長影響的基礎(chǔ)上，為探討果樹葉片生長對(duì)根際硝態(tài)氮產(chǎn)生較快反應(yīng)的機(jī)理，以水培平邑甜茶幼苗為試材，克隆根系細(xì)胞分裂素合成酶(異戊烯基轉(zhuǎn)移酶)編碼基因(MhIPT3)，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究MhIPT3表達(dá)量的變化，采用酶聯(lián)免疫測(cè)定植株中Z+ZR與iP+iPA、IAA、ABA含量的改變，并測(cè)定分析了不同供氮形態(tài)對(duì)植株生長的影響，主要結(jié)果如下： 1.根據(jù)已知蘋果異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因的EST序列，設(shè)計(jì)

2、特異引物利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)獲得了異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為MhIPT3。GenBank注冊(cè)號(hào)為DQ792508。序列分析表明，MhIPT3 cDNA全長1314 bp，含有963 bp的完整開放閱讀框，編碼分子量為37.3 KD的321個(gè)氨基酸；結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，MhIPT3蛋白上含有ATP/ADP結(jié)合位點(diǎn)；同源性分析發(fā)現(xiàn)，MhlPT3蛋白與AtPTl，AtIPT3，AtIPT4，AtIPT5，AtIPT6，AtIPT7和At

3、IPT8蛋白同源性分別為34.22％，53.27％，35.34％，55.29％，35.11％，47.43％和38.14％，而與AtIPT2和AtIPT9氨基酸同源性僅為25.1％和25.52％；聚類分析表明，MhIPT3蛋白與LjIPT3(Lotus japonicus)、AtIPT3 (Arabidopsis thaliana)和BrIPT3(Brassica rapa L.)蛋白的同源性最高。以平邑甜茶的DNA為模板進(jìn)行MhIPT3

4、編碼區(qū)的克隆，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所克隆的序列與以cDNA為模板所克隆的編碼區(qū)序列完全相同，說明MhIPT3編碼區(qū)內(nèi)沒有內(nèi)含子。構(gòu)建了pBI121-MhIPT3正反義表達(dá)載體，并對(duì)煙草和‘皇家嘎拉’蘋果進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染的遺傳轉(zhuǎn)化。將MhIPT3編碼區(qū)正向克隆到原核表達(dá)載體pET30a-c(+)，并通過原核表達(dá)獲得了MhIPT3蛋白，為進(jìn)一步研究異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的功能提供了條件。 2.熒光定量PCR分析MhIPT3的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MhIPT3基因在平

5、邑甜茶的根、莖、葉中均有表達(dá)且在葉中的表達(dá)量最高。對(duì)N饑餓的平邑甜茶施用NO3-0.5 h后MhIPT3的表達(dá)量開始增加，2 h后達(dá)到最大，但NH4+處理對(duì)MhIPT3的表達(dá)沒有影響；根中iP+iPA和Z+ZR與MhIPT3表達(dá)量呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)。處理24 h，NO3-處理與NH4+處理IAA含量差異不顯著，ABA含量NO3處理高于NH4+處理：到第72 h與168 h，IAA含量差異仍然不顯著，ABA含量NO3-處理低于NH4+處理