人類GITR基因的克隆表達(dá)及其相關(guān)功能的初步研究.pdf

1、目的：克隆人類糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體( humanglucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor,hGITR)基因，原核表達(dá)并純化hGITR胞外段融合蛋白；制備針對(duì)hGITR胞外段融合蛋白的兔源性多抗并加以鑒定，并探討該多抗對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖能力的影響。為進(jìn)一步研究人類GITR/GITRL的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1)采用RT-P

2、CR方法，從正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞獲得hGITR基因的cDNA，克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α宿主菌，行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)一步行酶切以及PCR鑒定，將初步確定的陽性克隆測序鑒定。
　　 2)以PCR方法從陽性TA克隆中獲得hGITR胞外段(hGITRaa27-165)基因，連接至pQE30質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliJM109宿主菌，選擇陽性株，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行BamHI、HindⅢ雙酶切及PCR鑒定。

3、　　 3)以陽性重組質(zhì)粒pQE30-hGITRaa27-165轉(zhuǎn)化E.coliM15宿主菌，通過酶切、PCR鑒定陽性菌株。接種陽性菌于3ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37℃，250rpm，12～16小時(shí)，以1/100的比例接種新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，分別加入終濃度為0.5、0.75、1mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG），分別在

4、25℃、30℃、37℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)，0，2，4，6，8小時(shí)分別取菌液離心收集細(xì)菌，通過SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)蛋白，確定最適IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，將所表達(dá)的hGITRaa27-165融合蛋白用Profinity IMAC Ni-Charged Resin親和層析柱分離純化，純化后蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western Blot鑒定。
　　 4)將hGITRaa27-165融合蛋白與弗氏佐劑充分乳化后，免疫家兔

5、，制備抗hGITR胞外段抗血清，并以Protein A Sepharose柱純化、交叉吸附去除非特異性抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測其效價(jià)，Western Blot及流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)鑒定多克隆抗體特異性，以多克隆抗體刺激CD4+T細(xì)胞，通過3H-TdR摻入法檢測CD4+T細(xì)胞的增殖狀況。
　　 結(jié)果：
　　 1)

6、成功構(gòu)建pGEM-T-GITR載體。測序結(jié)果顯示連接至pGEM-T載體的目的片段-hGITR基因，編碼區(qū)cDNA的全長726bp，編碼241個(gè)氨基酸殘基，與GenBank中發(fā)表的序列完全一致。
　　 2)成功構(gòu)建pQE30-hGITR aa27-165原核表達(dá)重組質(zhì)粒。PCR及BamHI、HindⅢ雙酶切后，均可見417bp目的條帶，測序結(jié)果通過Pubmed Blast發(fā)現(xiàn)與GenBank中的序列一致。確定終濃度0.5mmol/

7、LIPTG，溫度30℃，誘導(dǎo)時(shí)間6h為最佳誘導(dǎo)條件，通過Profinity IMAC Ni-Charged Resin親和層析柱純化目的蛋白，獲得原核表達(dá)的hGITR aa27-165融合蛋白，大小約為15.6KD。
　　 3)免疫家兔獲得抗hGITR aa27-165融合蛋白多克隆抗體?？贵w經(jīng)純化處理后ELISA檢測效價(jià)為1：1.6×105，Western Blot與FCM檢測顯示其具有較好反應(yīng)性和特異性，并且該多抗可以增強(qiáng)C