牛結(jié)核病膠體金免疫層析方法的建立與初步運用.pdf

1、本研究對四種牛分枝桿菌抗原蛋白(MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6)進(jìn)行了融合表達(dá)，旨在為牛結(jié)核病臨床診斷提供一種敏感、特異的診斷抗原。利用牛分枝桿菌的兩個同源蛋白質(zhì)MPB70和MPB83，建立了一種雙抗原夾心膠體金免疫層析法。旨在為牛結(jié)核病的臨床診斷提供一種敏感、特異、快速、實用的新型診斷方法。主要研究內(nèi)容包括： 1．牛分枝桿菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表達(dá)及相關(guān)特性分析

2、 克隆了牛分枝桿菌特異性抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的編碼基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，提純?nèi)诤系鞍踪|(zhì)，并對其特性及其在牛結(jié)核病血清學(xué)診斷中的價值進(jìn)行了初步評估。經(jīng)ELISA驗證該融合蛋白能分別與抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfpl0-esat6)的多抗反應(yīng)，說明該融合蛋白具有四個抗原蛋白的免疫學(xué)活性。Western blot分析顯示：該融合蛋白能與抗牛分枝桿菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與牛

3、副結(jié)核病、牛布氏桿菌病、牛巴貝斯病和牛傳染性鼻氣管炎病陽性血清不反應(yīng)。熱穩(wěn)定性試驗證明該融合蛋白具有與單個蛋白相同的熱穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，融合蛋白具有單個蛋白的免疫原性和穩(wěn)定性，作為一種新型的診斷抗原具有良好的應(yīng)用前景。 2．牛結(jié)核病抗體膠體金快速檢測技術(shù)的建立 利用膠體金免疫層析技術(shù)原理，用原核誘導(dǎo)表達(dá)的牛分枝桿菌抗原蛋白MPB83和MPB70分別作為膠體金標(biāo)記抗原和檢測線上的捕獲抗原，制備牛結(jié)核抗體檢測試紙條。結(jié)果粒徑

4、為40nm的膠體金制備的試紙條敏感性最高；膠體金最佳標(biāo)記pH值為6.0；MPB83抗原最適標(biāo)記量為每毫升膠體金6.5μg；MPB70抗原的最適包被濃度為3.0mg/mL；抗MPB83蛋白IgG的最佳包被濃度為2.5mg/mL；交叉試驗證明試紙條不與牛的其它非相關(guān)疾病的陽性血清反應(yīng)，具有較高的特異性。比較實驗證明其敏感性顯著高于進(jìn)口試紙條。 3．牛結(jié)核病抗體膠體金快速檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用 應(yīng)用牛結(jié)核病抗體膠體金快速檢測方法制