TGEV雙抗體夾心ELISA方法建立與膠體金免疫層析試紙條的制備.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)主要引起豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)，TGE是一種急性、高度接觸性的腸道傳染病，主要引起仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水，尤其兩周齡以內(nèi)仔豬致死率可達(dá)100％。該病傳播迅速給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)極大的損失。目前對(duì)于該病的檢測(cè)方法有多種，但多數(shù)適用于實(shí)驗(yàn)室診斷，缺少適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速準(zhǔn)

2、確檢測(cè)方法，以期在豬感染早期做出快速診斷，采取有效的防控措施來(lái)減少TGE爆發(fā)帶來(lái)的損失。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要用抗TGEV N蛋白單抗(MAb)和抗TGEV N蛋白多抗血清(PcAb)建立一種檢測(cè)TGEV雙抗體夾心ELISA方法。該方法選用N蛋白作為靶蛋白是因N蛋白為病毒核蛋白，具有高度保守性，在病毒中含量高，與其他病毒無(wú)交叉性反應(yīng)，便于該方法準(zhǔn)確診斷，但由于N蛋白位于病毒內(nèi)部，如何從病毒中釋放出N蛋白是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，研

3、制出一種病毒N蛋白裂解液，其主要成分有SDS、Tris，實(shí)驗(yàn)證明將裂解液與病毒混合，4℃靜置30min，一抗為抗TGEVN蛋白單抗，經(jīng)雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)，可以檢測(cè)到裂解中病毒N蛋白。后期對(duì)裂解液進(jìn)行優(yōu)化組合，篩選出加入Triton-100時(shí)，病毒N蛋白能充分釋放從而提高檢測(cè)靈敏度。與韓國(guó)試劑盒中裂解液進(jìn)行比較，臨床樣品作為待檢樣品，結(jié)果表明自制裂解液的裂解效果與后者一致，因其制備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，可以作為裂解TGEV及其冠狀病毒

4、的常用裂解液。
　　 病毒蛋白裂解液是建立檢測(cè)TGEV雙抗體夾心ELISA方法的前提，抗體的純度是該方法建立的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法粗提純MAb和PcAb，用蛋白A(G)親和層析法進(jìn)一步純化，純化后用間接ELISA、SDS-PAGE和蛋白分光光度計(jì)檢測(cè)其效價(jià)、提純結(jié)果和抗體濃度。經(jīng)SDS-PADE結(jié)果顯示，單抗和多抗血清經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法粗純化后稍有些雜帶，經(jīng)親和層析方法進(jìn)一步純化后抗體沒(méi)有雜帶，IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶

5、明顯，純度為100％;單抗效價(jià)由1.28×107下降為1.028×106，多抗血清的效價(jià)由1.28×106下降為5.12×105;純化后經(jīng)蛋白分光光度計(jì)檢測(cè)單抗和多抗在280nm處只有一個(gè)波峰，蛋白濃度分別為2.772mg/mL和3.924mg/mL。同時(shí)對(duì)建立的雙抗體夾心ELISA方法各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，純化抗TGEVN蛋白MAb包被濃度為0.4μg/mL，兔抗TGEVN蛋白PcAb工作濃度為3.5μg/mL，酶標(biāo)二抗的工

6、作濃度為1∶5000，樣品最佳孵育時(shí)間為37℃60 min，陽(yáng)性血清OD490nm值接近1.0，P/N值最大。
　　 為了進(jìn)一步達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求，本實(shí)驗(yàn)在雙抗體夾心方法的原理上利用膠體金免疫層析技術(shù)，在準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上快速檢測(cè)TGEV，以期提高對(duì)該病的正確診斷和防治。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，在10mL體系氯金酸溶液中加入150ul檸檬酸鈉，肉眼觀察膠體金顆粒顏色均一，呈酒紅色，有明顯光暈，經(jīng)電鏡觀察

7、膠體金顆粒大小一致，顆粒直徑在20nm左右。經(jīng)紫外掃描金顆粒，其峰寬較窄，表明膠體金溶液分散性良好。最大吸收峰為530nm，適于標(biāo)記單克隆抗體。優(yōu)化金標(biāo)顆粒的最適條件和試紙條的組成成分，結(jié)果顯示:標(biāo)記最適pH值pH6.4，最佳標(biāo)記量233μg/mL。選擇BSA、蔗糖、海藻糖等成分作為金標(biāo)抗體懸液可以提高金標(biāo)記的抗體活性。將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體吸附于玻璃纖維，用純化的PcAb和羊抗鼠IgG分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線組裝試紙條，TGEV培養(yǎng)液和未接

8、種病毒的細(xì)胞上清液作為已知陽(yáng)性和陰性樣品，檢測(cè)時(shí)間為10～20min，同時(shí)對(duì)試紙條進(jìn)行特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和臨床樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。試紙條判定依據(jù)為檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶為陽(yáng)性結(jié)果，若僅質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶為陰性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:試紙條不與豬流行性腹瀉病毒、豬細(xì)小病毒等相關(guān)腹瀉病毒發(fā)生反應(yīng)，表明試紙條特異性良好;做重復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果顯示無(wú)明顯差異;經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果顯示制備的試紙條穩(wěn)定性良好;將本實(shí)驗(yàn)制備的試紙條進(jìn)行臨床樣品檢測(cè)，并與