TGEV雙抗體夾心ELISA方法建立與膠體金免疫層析試紙條的制備.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)主要引起豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)，TGE是一種急性、高度接觸性的腸道傳染病，主要引起仔豬嘔吐、嚴重腹瀉、脫水，尤其兩周齡以內(nèi)仔豬致死率可達100％。該病傳播迅速給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的損失。目前對于該病的檢測方法有多種，但多數(shù)適用于實驗室診斷，缺少適用于現(xiàn)場的快速準

2、確檢測方法，以期在豬感染早期做出快速診斷，采取有效的防控措施來減少TGE爆發(fā)帶來的損失。
　　 本實驗主要用抗TGEV N蛋白單抗(MAb)和抗TGEV N蛋白多抗血清(PcAb)建立一種檢測TGEV雙抗體夾心ELISA方法。該方法選用N蛋白作為靶蛋白是因N蛋白為病毒核蛋白，具有高度保守性，在病毒中含量高，與其他病毒無交叉性反應(yīng)，便于該方法準確診斷，但由于N蛋白位于病毒內(nèi)部，如何從病毒中釋放出N蛋白是本實驗的關(guān)鍵。經(jīng)實驗研究，研

3、制出一種病毒N蛋白裂解液，其主要成分有SDS、Tris，實驗證明將裂解液與病毒混合，4℃靜置30min，一抗為抗TGEVN蛋白單抗，經(jīng)雙抗體夾心ELISA方法檢測，可以檢測到裂解中病毒N蛋白。后期對裂解液進行優(yōu)化組合，篩選出加入Triton-100時，病毒N蛋白能充分釋放從而提高檢測靈敏度。與韓國試劑盒中裂解液進行比較，臨床樣品作為待檢樣品，結(jié)果表明自制裂解液的裂解效果與后者一致，因其制備簡單、操作簡便，可以作為裂解TGEV及其冠狀病毒

4、的常用裂解液。
　　 病毒蛋白裂解液是建立檢測TGEV雙抗體夾心ELISA方法的前提，抗體的純度是該方法建立的基礎(chǔ)。本實驗經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法粗提純MAb和PcAb，用蛋白A(G)親和層析法進一步純化，純化后用間接ELISA、SDS-PAGE和蛋白分光光度計檢測其效價、提純結(jié)果和抗體濃度。經(jīng)SDS-PADE結(jié)果顯示，單抗和多抗血清經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法粗純化后稍有些雜帶，經(jīng)親和層析方法進一步純化后抗體沒有雜帶，IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶

5、明顯，純度為100％;單抗效價由1.28×107下降為1.028×106，多抗血清的效價由1.28×106下降為5.12×105;純化后經(jīng)蛋白分光光度計檢測單抗和多抗在280nm處只有一個波峰，蛋白濃度分別為2.772mg/mL和3.924mg/mL。同時對建立的雙抗體夾心ELISA方法各個條件進行優(yōu)化，實驗結(jié)果顯示，純化抗TGEVN蛋白MAb包被濃度為0.4μg/mL，兔抗TGEVN蛋白PcAb工作濃度為3.5μg/mL，酶標二抗的工

6、作濃度為1∶5000，樣品最佳孵育時間為37℃60 min，陽性血清OD490nm值接近1.0，P/N值最大。
　　 為了進一步達到現(xiàn)場檢測要求，本實驗在雙抗體夾心方法的原理上利用膠體金免疫層析技術(shù)，在準確的基礎(chǔ)上快速檢測TGEV，以期提高對該病的正確診斷和防治。
　　 本實驗主要采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，在10mL體系氯金酸溶液中加入150ul檸檬酸鈉，肉眼觀察膠體金顆粒顏色均一，呈酒紅色，有明顯光暈，經(jīng)電鏡觀察

7、膠體金顆粒大小一致，顆粒直徑在20nm左右。經(jīng)紫外掃描金顆粒，其峰寬較窄，表明膠體金溶液分散性良好。最大吸收峰為530nm，適于標記單克隆抗體。優(yōu)化金標顆粒的最適條件和試紙條的組成成分，結(jié)果顯示:標記最適pH值pH6.4，最佳標記量233μg/mL。選擇BSA、蔗糖、海藻糖等成分作為金標抗體懸液可以提高金標記的抗體活性。將標記好的金標抗體吸附于玻璃纖維，用純化的PcAb和羊抗鼠IgG分別作為檢測線和質(zhì)控線組裝試紙條，TGEV培養(yǎng)液和未接

8、種病毒的細胞上清液作為已知陽性和陰性樣品，檢測時間為10～20min，同時對試紙條進行特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和臨床樣品檢測實驗。試紙條判定依據(jù)為檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶為陽性結(jié)果，若僅質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶為陰性結(jié)果。實驗結(jié)果顯示:試紙條不與豬流行性腹瀉病毒、豬細小病毒等相關(guān)腹瀉病毒發(fā)生反應(yīng)，表明試紙條特異性良好;做重復(fù)檢測試驗，結(jié)果顯示無明顯差異;經(jīng)穩(wěn)定性試驗，結(jié)果顯示制備的試紙條穩(wěn)定性良好;將本實驗制備的試紙條進行臨床樣品檢測，并與