免疫膠體金

1、?1?第六節(jié)免疫膠體金技術(shù)(Immunecolloidalgoldtechnique)一、概況（一）（一）原理原理免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)

2、合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。（二）（二）膠體金的制備膠體金的制備根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來(lái)制備膠體金顆粒的方法如下。1枸櫞酸三鈉還原法（1）10nm膠體金粒的

3、制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4℃，溶液呈紅色。（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min～30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1MolLK2CO30.5ml，混勻即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100

4、ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶?3?液中4℃透析過(guò)夜，以除去多余的鹽離子，然后100000g4℃離心1h，去除聚合物。2待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備以0.1MolLK2CO3或0.1MolLHCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb時(shí)調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.9～6.2；標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至9～10。由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因

5、此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。3膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。（2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005MolLpH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5gml～50gml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml10％NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。（4）結(jié)果觀察，對(duì)照管（未加

6、蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加10％～20％。4膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合將膠體金和IgG溶液分別以0.1MolLK2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金

7、聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1％；1％聚乙二醇加至總?cè)芤旱?／10。5膠體金標(biāo)記蛋白的純化（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1200rmin，5nm金膠粒用1800rmin）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm