增強(qiáng)型綠色熒光蛋白嵌合腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、近年來(lái)，包括我國(guó)在內(nèi)的東亞地區(qū)多次爆發(fā)由腸道病毒感染導(dǎo)致的手足口病(hand-foot and mout disease，HFMD)疫情。腸道病毒71型(EV71)是HFMD主要病原體之一，其重癥患者比例以及病死率均明顯高于其他腸道病毒，具有非常重要的公共衛(wèi)生意義。然而，目前尚無(wú)有效的針對(duì)性治療方法和預(yù)防疫苗，同時(shí)對(duì)于EV71的感染、致病機(jī)制等仍有許多基礎(chǔ)問(wèn)題有待闡明。因此，需要進(jìn)一步建立和完善針對(duì)EV71的研究技術(shù)和方法，這對(duì)支持EV

2、71的防控研究是十分必要的。本研究目的是以EV71感染性克隆為基礎(chǔ)建立一種新型的帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的重組EV71病毒，并鑒定該重組病毒的特性及應(yīng)用潛力，同時(shí)嘗試建立一種基于EGFP標(biāo)記病毒的EV71中和抗體快速檢測(cè)方法。本研究結(jié)果可為EV71的防治研究提供重要的基礎(chǔ)和工具。
　　 EV71病毒基因組大小約為7.5kb，僅有一個(gè)開(kāi)發(fā)閱讀框。本研究應(yīng)用重組PCR技術(shù)在病毒ORF區(qū)與5'UTR區(qū)之間插入一個(gè)EGFP

3、基因及一個(gè)編碼-AITTL多肽的寡核苷酸序列。-AITTL-是能被病毒自身的特異性2A蛋白酶識(shí)別的多肽，經(jīng)過(guò)2A蛋白酶的剪切，能將EGFP與病毒蛋白解離。因此，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白嵌合的EV71病毒既能像普通EV71一樣感染細(xì)胞并復(fù)制，具有相同的抗原性，同時(shí)又能夠表達(dá)具有示蹤作用的EGFP。通過(guò)T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，該嵌合感染性克隆拯救得到的病毒(EV71-EGFP)，能夠進(jìn)行穩(wěn)定的傳代。通過(guò)檢測(cè)病毒感染后表達(dá)的EGFP，可用于快速檢測(cè)和追蹤EV

4、71對(duì)細(xì)胞的感染情況。本研究應(yīng)用EV71-EGFP感染多種不同組織來(lái)源的細(xì)胞系，通過(guò)分析感染細(xì)胞中的EGFP表達(dá)情況評(píng)價(jià)了不同細(xì)胞對(duì)EV71病毒的易感性。EGFP嵌合EV71重組病毒可為EV71的受體研究和抗病毒藥物研究提供參考和便利。
　　 同時(shí)，本研究應(yīng)用EV71-EGFP初步建立了一種新型的快速、高通量的EV71中和抗體檢測(cè)方法。該方法是應(yīng)用本研究構(gòu)建的帶有綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的EV71病毒感染RD細(xì)胞，18小時(shí)后利用Be

5、ckman公司的paradigm analysis系統(tǒng)測(cè)定樣品孔中的EGFP熒光強(qiáng)度，進(jìn)而計(jì)算出待測(cè)樣品的中和抗體滴度。此方法可利用自動(dòng)化的儀器設(shè)備進(jìn)行快速檢測(cè)，客觀性好，避免了傳統(tǒng)方法的主觀誤差，有利于進(jìn)行快速高通量檢測(cè)。本研究進(jìn)一步對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化和性能評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示該方法與傳統(tǒng)的CPE中和方法以及的Elispot中和方法具有良好的相關(guān)性，三種方法的檢測(cè)結(jié)果平行比較體現(xiàn)出較好的一致性。同時(shí)，本研究應(yīng)用該方法檢測(cè)了部分EV71單抗和多