腸道病毒分子流行病學及腸道病毒71型感染致炎癥反應機制研究.pdf

1、腸道病毒71型(EV71)是導致手足口病重癥病例的重要病原體之一，具有明顯的嗜神經(jīng)性，可導致腦炎、腦干腦炎、無菌性腦膜炎、腦脊髓炎、脊髓灰質(zhì)炎樣綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)病變。EV71于1969年首次在美國加州患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新生兒糞便標本中分離出來，此后在歐亞國家及我國全國范圍內(nèi)廣泛流行，累及我國各省、市和自治區(qū)。規(guī)模較大、較為嚴重的一次為1998年在臺灣爆發(fā)的EV71流行，在該次流行中，共有405例重癥患兒，其中78例死亡，死亡率占重癥患者

2、的19.2％。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計，2012年，全國手足口病患病人數(shù)已達到2168737人，死亡567人。其死亡原因主要由于EV71感染引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應并導致肺水腫、心肌炎等并發(fā)癥，但其致炎癥反應發(fā)生機制目前還不明確。在治療方面，尚缺乏特異、高效的抗病毒藥物，抑制炎癥反應和對癥治療是主要治療措施。在EV71感染的臨床治療中，糖皮質(zhì)激素常被用于抑制神經(jīng)的炎癥反應，但其對機體全身性的免疫抑制，具有較大的毒副作用并可導致病毒感染擴散，易引起繼

3、發(fā)性細菌感染等嚴重不良反應。因此，為應對EV71的流行及降低死亡率，充分認識EV71感染導致的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應機制顯得極為重要。
　　利用流行病學和分子流行病學對河南無菌性腦膜炎疫情和山東臨沂手足口病疫情進行分析。引起河南無菌性腦膜炎疫情的病原體為柯薩奇B5病毒，系統(tǒng)進化分析顯示該病毒屬于E亞型，重癥分離株在進化上形成一單獨分支，VP1區(qū)95位點氨基酸可能為CVB5病毒重要的毒力決定簇。引起山東臨沂手足口病疫情的病原體為腸道病毒7

4、1型，系統(tǒng)進化分析顯示該病毒屬于C4亞型，此次疫情毒株由3條傳播鏈進行傳播，重癥分離株與輕癥分離株在VP1區(qū)145位氨基酸差異顯著，說明該位點可能為EV71病毒重要的毒力決定簇。腸道病毒引起的手足口病在國內(nèi)廣泛流行，對嬰幼兒的身體健康帶來嚴重威脅。通過對腸道病毒流行的大量監(jiān)測，我們發(fā)現(xiàn)基因變異促進了病毒毒力增強，從而加重了感染所引起的癥狀。然而，EV71致病機制目前尚不十分清楚，致病機制研究還處于摸索階段。EV71在國內(nèi)流行主要以C4亞

5、型為主，而C4亞型對動物敏感性低，感染動物模型極不易構(gòu)建，為研究C4亞型的致病機制帶來了阻礙。為應對國內(nèi)EV71感染的嚴峻形勢，我們利用EV71 C4亞型毒株(AH08/06)建立感染小鼠致炎癥反應模型，以此來研究EV71感染致炎機制，為有效控制EV71感染，開發(fā)特異性抗病毒藥物和疫苗開拓新思路。
　　首先，我們對EV71感染小鼠模型生存、體征情況進行觀察。腹腔注射EV71病毒(10-7TCID50)感染1日齡昆明小鼠，小鼠感染后

6、會出現(xiàn)消瘦、震顫、頸部僵硬、抽搐、肢體癱瘓等典型發(fā)病癥狀。感染組小鼠從第4天開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡，第6天全部死亡。感染組從第2天開始，體重增長趨于平緩，直到第6天全部死亡為止，感染組第3-6天體重顯著低于空白對照組(P＜0.05)。感染組小鼠從第3天開始活動力明顯降低，第4天出現(xiàn)后肢癱瘓，第6天不能活動、無法進食、呼吸衰竭。感染后3-6天出現(xiàn)定向障礙。沒有出現(xiàn)皮膚出疹的情況。從生存率上可以看出AH08/06株對小鼠極為敏感，屬于鼠適應株。在

7、體征上，本模型基本符合人感染EV71重癥癥狀，適合進一步開展致病機制研究。
　　為了解小鼠體內(nèi)感染EV71的分布情況以及EV71在體內(nèi)的傳播方式，我們采用實時定量PCR、組織病毒滴度測定、免疫組織化學等技術(shù)手段對EV71感染小鼠1-6天的血、腦、肺、小腸、后肢肌肉、肝、脾、腎等組織器官病毒時空分布進行測定。結(jié)果顯示，在時間順序上，小鼠感染1天后僅在血中檢測到病毒，小腸、肺、骨骼肌、脊髓在感染2天后可檢測到病毒，腦是最后檢測出病毒的

8、組織，肝、腎、脾均沒有發(fā)現(xiàn)病毒感染。在感染病毒累積量上，血液在整個感染過程中病毒滴度比較平緩，說明感染造成了持續(xù)的病毒血癥;骨骼肌內(nèi)病毒滴度明顯高于其它組織，說明骨骼肌是EV71復制的最主要靶器官;腦和脊髓感染的病毒量僅次于骨骼肌，也是EV71攻擊的主要靶器官，另外，免疫組化結(jié)果顯示，EV71在中樞神經(jīng)系統(tǒng)僅感染腦干和脊髓的神經(jīng)元;小腸和肺感染量最低。根據(jù)以上結(jié)果，我們可以推測出EV71在體內(nèi)以兩種方式進行傳播:首先，病毒進入腹腔后，可

9、能通過淋巴組織迅速進入血液，同時感染小腸，隨后病毒隨血液傳播到骨骼肌、肺等靶組織感染并在其內(nèi)復制。其次，在感染時間上脊髓要先于腦，而腦的感染時間要滯后于其它組織器官，同時免疫組化結(jié)果顯示EV71感染腦部僅能感染腦干部位，這說明EV71進入腦是從脊髓傳播而來，因此EV71進入腦部可能是按照從外周神經(jīng)到脊髓再到腦的神經(jīng)通路進行傳播。
　　為了解EV71感染對組織的損傷程度，我們利用HE染色對EV71感染小鼠各器官進行組織病理學檢測。E

10、V71感染小鼠腦部僅腦干檢測到病毒感染，腦干受損傷神經(jīng)元附近出現(xiàn)大量的單核細胞浸潤現(xiàn)象，多發(fā)性增生的膠質(zhì)細胞聚集形成膠質(zhì)小結(jié);部分神經(jīng)元顯著腫脹、變性、壞死，噬神經(jīng)細胞現(xiàn)象明顯;小血管周圍出現(xiàn)袖套樣炎性細胞浸潤，以單核、淋巴細胞為主及少量中性粒細胞，說明腦干發(fā)生了劇烈的炎癥反應。骨骼肌內(nèi)發(fā)生明顯的肌纖維斷裂，出現(xiàn)大量的炎性細胞，造成嚴重的壞死性肌炎。小腸感染后并沒有發(fā)生明顯的病理變化，說明小腸對機體免疫反應的耐受作用要明顯大于其它組織。

11、心臟出現(xiàn)灶性收縮帶壞死，血管淤血、部分管腔單核、淋巴細胞比例增高。肺部支氣管壁炎性細胞浸潤，肺泡壁增寬伴數(shù)量不等的單核細胞、淋巴細胞浸潤，部分肺泡不張、實變，或肺泡腔見較多巨噬細胞及多核巨細胞。肝臟局部出現(xiàn)以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤細胞。脾中性粒細胞浸潤，脾竇淤血。腎小球附近及腎盂出現(xiàn)炎性細胞浸潤。以上結(jié)果顯示，腦干、脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴重，EV71嗜神經(jīng)現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)嚴重的腦干腦炎和腦脊髓炎，與人感染EV71死亡病例腦干炎癥損傷

12、情況極為相似，因此這可能成為EV71感染小鼠致死的最主要原因。骨骼肌、肺、肝、脾、腎等多器官系統(tǒng)性炎癥反應，進一步加速了感染小鼠的死亡。
　　為了解EV71感染對器官功能的損傷程度，我們對EV71感染小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)等肝腎功能指標進行測定，發(fā)現(xiàn)ALT、AST、BUN在感染末期發(fā)生明顯改變，說明在感染后期肝腎功能發(fā)生異常。組織病毒檢測并沒有在肝腎發(fā)現(xiàn)EV71感染

13、，但病理學檢查顯示肝腎在感染后期均出現(xiàn)不同程度的炎癥反應，從而導致肝腎功能發(fā)生異常。因此，可以推測肝腎損傷可能由神經(jīng)或免疫調(diào)節(jié)紊亂導致，同時肝腎功能失調(diào)也會加速感染小鼠的死亡，這將有助于我們進一步了解EV71感染引起的神經(jīng)和免疫調(diào)節(jié)機制。
　　為研究EV71感染小鼠炎癥發(fā)生機制，我們對EV71感染小鼠血清31種細胞因子進行流氏細胞測定，發(fā)現(xiàn)G-CSF、IL-1α、IL-6、IP-10、KC、MCP-1、MIP-1β、RANTES、

14、IFN-γ、TNF-α等10種因子在EV71感染過程中發(fā)生明顯變化，說明EV71感染引起體內(nèi)細胞因子風暴產(chǎn)生。細胞因子在抗病毒反應、參與炎癥反應、調(diào)節(jié)免疫方面具有重要作用。IL-6、IFN-γ、 IP-10、MIP-1β和TNF-α是參與炎癥反應主要因子，其水平大幅升高，說明EV71感染小鼠體內(nèi)發(fā)生劇烈炎癥反應，同時這些因子已成為預測EV71感染重癥的標志檢測物。細胞因子風暴的產(chǎn)生不僅能保護機體防御病毒入侵，還能嚴重地影響了機體的免疫耐

15、受作用，也是引起EV71重癥、死亡病例的重要原因。因此，EV71感染小鼠細胞因子變化水平，進一步闡明了機體在EV71感染過程中的免疫調(diào)節(jié)機制，對降低EV71感染重癥患者的病死率有重要意義。
　　綜合國內(nèi)外研究結(jié)果以及我們動物實驗結(jié)果，腦部炎性損傷是EV71感染重癥及死亡的主要原因。因此，我們重點關(guān)注EV71感染小鼠腦部炎性損傷機制。而補體系統(tǒng)是炎癥反應發(fā)生的中心，在H1N1流感等病毒的致炎機制中起關(guān)鍵作用。因此，本研究也重點關(guān)注補

16、體系統(tǒng)在EV71腦部炎性損傷中所起的作用。通過對補體C3d蛋白免疫組化分析顯示，EV71感染小鼠腦干和肌肉炎癥反應發(fā)生部位部位出現(xiàn)C3d沉積，這表明補體系統(tǒng)激活。Western blot結(jié)果顯示，腦部補體C3d蛋白在感染前期和后期大量表達，推測補體系統(tǒng)以兩種不同激活途徑參與抗病毒和炎癥反應。補體抑制因子DAF和CD59mRNA表達量由前期升高迅速轉(zhuǎn)為下降，表明在EV71感染小鼠過程，補體系統(tǒng)在感染前期參與了抗病毒反應和趨化炎癥因子反應，

17、而后期補體系統(tǒng)由于補體調(diào)控分子的抑制作用下降，直接導致機體的耐受力下降，結(jié)合補體大量激活，從而加劇了炎癥反應的程度，其產(chǎn)生的MAC也對機體正常組織產(chǎn)生傷害。由此，我們可以推測，補體在EV71感染至炎癥反應和機體耐受力方面可能起到了至關(guān)重要的作用。
　　有文獻報道m(xù)iRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和免疫調(diào)節(jié)方面起重要的調(diào)控作用。在分子水平上，我們對miRNA對EV71感染小鼠致腦部炎癥反應調(diào)控機制進行了初步研究。利用miRNA芯片對EV71感

18、染3天和6天的小鼠miRNA表達譜進行了檢測。在EV71感染小鼠腦中共檢測出398條microRNA。感染3天的microRNA表達譜明顯不同于感染6天。感染3天與對照3天microRNA表達差異不明顯，而感染6天與對照6天的microRNA表達出現(xiàn)較大差異。因此，在EV71感染小鼠過程中，microRNA表達隨時間變化。EV71感染后3天，感染組僅有2個miRNA發(fā)生下調(diào)，而感染后6天，感染組有38個miRNA發(fā)生下調(diào)，22個miRN

19、A發(fā)生上調(diào)。這表明EV71感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程中，miRNA發(fā)揮了調(diào)控作用。對差異表達miRNA預測靶標進行GO分析和pathway分析，發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA對軸突導向通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、神經(jīng)生長因子通路等神經(jīng)活動、免疫調(diào)節(jié)途徑調(diào)控作用明顯，這表明腦內(nèi)miRNA參與了EV71感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應的調(diào)控，為深入了解EV71感染致炎機制提供分子基礎。
　　綜合上述研究內(nèi)容，本研究對腸道病毒感染引起

20、的疫情進行流行病學和分子流行病學調(diào)查，分析腸道病毒基因的變異進化規(guī)律，為手足口病防控提供科學依據(jù)。本研究通過EV71感染致炎癥反應小鼠模型，確定EV71可感染腦、脊髓、骨骼肌、肺、小腸等多組織器官并造成炎癥反應和功能障礙，推斷EV71在小鼠體內(nèi)可能通過血液和神經(jīng)兩種途徑進行傳播，細胞因子和補體在炎癥反應和機體耐受方面起重要作用，并在分子水平上初步確定miRNA參與了EV71感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應的調(diào)控。本研究為EV71感染小鼠致炎