腸道病毒71型病毒蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的研究.pdf

1、目的:
　　1、探討EV71病毒(GenBank: JQ804832)與自噬相關(guān)性。
　　2、進(jìn)一步探討病毒蛋白與自噬相關(guān)性。
　　方法:
　　1、EV71對(duì)293T細(xì)胞的影響:用Reed-Muench法計(jì)算出病毒的TCID50，將293T細(xì)胞分為抑制劑+EV71組、誘導(dǎo)劑+EV71組、EV71感染組，未感染組，將3-MA與雷帕霉素作用1小時(shí)后，感染5moiEV71病毒，8小時(shí)后處理細(xì)胞，用Westen Blot

2、方法檢測(cè)293T細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的變化及P62的變化情況及用免疫熒光的方法檢測(cè)點(diǎn)片狀綠色熒光的形成情況。
　　2、EV71病毒蛋白對(duì)293T細(xì)胞的影響:應(yīng)用基因工程建立11種真核表達(dá)的重組質(zhì)粒，分別為pcDNA3.1(+)-HA-VP1、pcDNA3.1（+）-HA-VP2、pcDNA3.1(+)-HA-VP3、pcDNA3.1(+)-HA-VP4、pcDNA3.1(+)-HA-2A、pcDNA3.1(+)-HA-2B、p

3、cDNA3.1(+)-HA-2C、pcDNA3.1(+)-HA-3A、pcDNA3.1(+)-HA-3AB、pcDNA3.1(+)-HA-3C、pcDNA3.1(+)-HA-3D，經(jīng)同步雙限制性內(nèi)切除的方法驗(yàn)證及測(cè)定質(zhì)粒序列，正確后，將重組成功的質(zhì)粒各自同自噬檢測(cè)標(biāo)志物(pEGFP-LC3)一同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，用免疫熒光的方法察看綠色熒光點(diǎn)狀聚積及計(jì)數(shù)，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡查看LC3和EV71蛋白共定位，同時(shí)用Wester

4、n Blot檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的變化及P62的變化情況。
　　結(jié)果:在EV71感染已轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，可以看到，有點(diǎn)片狀的綠色熒光出現(xiàn)，且兩者表現(xiàn)出共定位。P62蛋白表達(dá)量出現(xiàn)降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值有所增加。
　　將pcDNA3.1(+)-HA-VP1等11種病毒蛋白分別與pEGFP-LC3共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染VP1與2A的細(xì)胞中可以看到多個(gè)明亮的綠色點(diǎn)片狀熒光，且weste