阿米福汀對(duì)放射后大鼠頜下腺水通道蛋白5表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、前言
　　對(duì)于頭頸部腫瘤而言，放射治療占有非常重要的地位。但是面頸聯(lián)合放療野中常包含雙側(cè)唾液腺，會(huì)不可避免的造成唾液腺的損傷。隨著近年來(lái)放射技術(shù)的飛速發(fā)展，包括適形調(diào)強(qiáng)放射治療等，或多或少保護(hù)了唾液腺的功能，但是放射性唾液腺損傷仍然不可避免。經(jīng)過(guò)常規(guī)照射治療后的頭頸部腫瘤的長(zhǎng)期生存者中，大多數(shù)患者有中、重度的持續(xù)性口腔干燥[1]，直接或間接引起很多口腔問(wèn)題:破壞口腔黏膜的完整性，增加患齲齒的危險(xiǎn)，導(dǎo)致疼痛、味覺(jué)喪失、吞咽咀嚼困難、

2、睡眠障礙以及口腔感染，最終會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良以及體重下降，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量[2]。因此，如何防護(hù)唾液腺的損傷成為頭頸部腫瘤放療的另一個(gè)關(guān)注焦點(diǎn)。
　　水通道蛋白5(AQP5)是涎腺細(xì)胞膜上重要的水通道蛋白，介導(dǎo)涎液中水的主動(dòng)運(yùn)輸，在唾液的分泌中起到重要的作用。有研究表明，放射線照射后，在大鼠模型中，頜下腺AQP5的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低.也有研究在輻射后急性和慢性階段的唾液腺組織中觀察到細(xì)胞凋亡增加，證明了水通道蛋白5表達(dá)降低及細(xì)胞

3、凋亡增加可能與放療引起的涎腺損傷有關(guān)。阿米福汀，又稱氨磷汀，是美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)上市的第1個(gè)泛細(xì)胞保護(hù)劑，可作為自由基清除劑，清除放療時(shí)體內(nèi)過(guò)多產(chǎn)生的自由基，從而提高DNA修復(fù)速率，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損害。在臨床方面，很多研究證實(shí)了阿米福汀可以降低急慢性口干的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)就阿米福汀對(duì)放射后AQP5表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響來(lái)進(jìn)一步探究阿米福汀對(duì)于放射性頜下腺損傷的保護(hù)機(jī)制。
　　材料與方法
　　一、材料
　　1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　

4、　SPF級(jí)Wistar大鼠30只，雌雄各半，月齡3個(gè)月，體重180-220g，購(gòu)置于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
　　2、主要的實(shí)驗(yàn)試劑
　　AQP5第一抗體及TUNEL試劑盒購(gòu)置于博士得公司，其余試劑及耗材購(gòu)至于北京中衫金橋生物有限公司及北京尚柏生物有限公司。
　　二、方法
　　1、建立動(dòng)物模型
　　將30只大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組。照射阿米福汀組（9只）:15Gy照射+amifostine200m

5、g/kg，照射前15min腹腔內(nèi)注射。照射鹽水組（9只）:15Gy照射+生理鹽水照射前15min腹腔內(nèi)注射。對(duì)照阿米福汀組（6只）:單純予amifostine200mg/kg腹腔內(nèi)注射。對(duì)照鹽水組（6只）:單純予生理鹽水腹腔內(nèi)注射;照射后1個(gè)月取頜下腺，用剪刀將其橫斷，一半迅速放于4％中性甲醛固定液中固定，48小時(shí)后轉(zhuǎn)入70％乙醇中保存;另一半放入-80℃深凍冰箱中保存。
　　2、頜下腺組織HE染色
　　將固定好的頜下腺組織

6、修材、脫水、透明、包埋制成蠟塊。切片做常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察頜下腺組織的改變情況。
　　3、免疫組化染色
　　將蠟塊切片做AQP5的免疫組化染色，顯微鏡下觀察大致的表達(dá)情況及通過(guò)計(jì)算機(jī)測(cè)定其平均光密度值。
　　4、Westernblot
　　分析利用儲(chǔ)存-80℃冰箱中的組織做Westernblot，測(cè)定AQP5蛋白的表達(dá)情況。
　　5、TUNEL法測(cè)細(xì)胞凋亡
　　蠟塊切片用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

7、，顯微鏡下觀察大致細(xì)胞凋亡情況、計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡指數(shù)。
　　結(jié)果
　　一、動(dòng)物模型建立情況
　　完成全部實(shí)驗(yàn)存活的大鼠共26只:照射阿米福汀組8只，照射鹽水組6只，對(duì)照阿米福汀組6只，對(duì)照鹽水組6只。
　　二、HE染色
　　鏡下觀察可見(jiàn)對(duì)照鹽水組，對(duì)照阿米福汀組的大鼠頜下腺細(xì)胞形態(tài)正常，照射鹽水組大鼠腺泡空泡樣變性明顯，大量的導(dǎo)管細(xì)胞退行性變及導(dǎo)管上皮細(xì)胞脫落，細(xì)胞間質(zhì)水腫及少量纖維化，然而照射阿米福

8、汀組的腺泡及導(dǎo)管空泡樣變及退行性程度明顯比照射鹽水劑組輕。
　　三、AQP5蛋白表達(dá)結(jié)果
　　免疫組化結(jié)果觀察了AQP5在正常頜下腺的定位表達(dá)及表達(dá)的變化，通過(guò)計(jì)算機(jī)測(cè)定其灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明AQP5主要位于腺泡細(xì)胞的細(xì)胞膜及腺泡細(xì)胞間的分泌小管，照射后30天照射鹽水組陽(yáng)性標(biāo)記灰度明顯減弱，蛋白表達(dá)與其他三組比較明顯降低(p＜0.05)，照射阿米福汀組蛋白表達(dá)雖低于對(duì)照阿米福汀組及對(duì)照鹽水組(p＜0.05)，但仍

9、高于照射鹽水組(p＜0.05)，兩對(duì)照組的AQP5表達(dá)部位與染色強(qiáng)度沒(méi)有明顯差異(p＞0.05)。Westernblot分析通過(guò)測(cè)定蛋白灰度值與用作內(nèi)參的GAPDH灰度值的比值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。
　　四、TUNEL檢測(cè)結(jié)果
　　TUNEL結(jié)果分析通過(guò)每張切片隨機(jī)選5個(gè)不重疊的高倍鏡視野(×400)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞指數(shù)（凋亡細(xì)胞數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù)），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:照射鹽水組頜下腺頜下腺凋