油酸性肺損傷大鼠水通道蛋白4表達及特布他林對其的影響.pdf

1、目的：
　　旨在以油酸造成SD大鼠急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）動物模型為研究對象，通過血氣分析、觀察肺組織病理、肺泡Ⅱ型上皮細胞形態(tài)改變來評價早期肺組織損傷的程度,測定AQP4在肺組織及肺泡Ⅱ型上皮細胞表達，進而觀察特布他林氣管滴入治療時，肺組織病理改變、血管外肺水（EVLW）的變化以及對肺組織及肺泡Ⅱ型細胞AQP-4的表達影響，從而分析特布他林藥物在急性肺損傷時如何通過影響肺水腫形成和上皮細胞來清除液體量變

2、化，進而影響肺水腫的形成，為研究刺激β2受體cAMP途徑對水通道蛋白的影響和可能存在的機制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.建立油酸肺損傷大鼠模型
　　選用2月齡二級雄性SD（Sprague Dawley）大鼠60只，實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，體重220±20克。按照序號完全隨機分為正常對照組、油酸制ALI肺損傷模型組，特布他林氣道治療組。每組各20只大鼠。三組大鼠均行氣管插管，模型組和特布他林組經(jīng)腹腔靜脈注入油酸0.

3、1ml/kg后，對照組注入等量生理鹽水。15分鐘后特布他林組氣管插管內(nèi)滴入特布他林2.5mg/kg，余各組滴入等量的生理鹽水。30分鐘后抽腹主動脈動脈血0.3ml血氣分析判斷肺損傷的程度。
　　2．致傷組大鼠肺組織損傷評價
　　腹腔靜脈注射油酸0.1ml/kg，30分鐘后抽血氣分析；治療后30分鐘腹主動脈放血活殺。通過HE病理染色采用Smith評分法對肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜形成五項分別進行0～

4、4分標準半定量分析：0級為無該項病理改變;1級為病理變化輕且很局限;2級為病理變化中等且局限;3級為病變中等但廣泛或局部很顯著;4級為非常顯著的廣泛性病理改變，求出各動物肺的各項病理改變程度的平均程度,作為肺損傷分數(shù)。動脈血氣分析判斷大鼠肺損傷模型是否成功建立。
　　3.大鼠ATⅡ細胞的分離、純化和鑒定
　　模型組、特布他林組及正常對照組的大鼠，取其肺組織，做好標記，分別采用改良的胰酶消化法分離肺泡Ⅱ型上皮細胞，用大鼠IgG

5、免疫粘附法純化細胞,臺盼蘭測細胞活力,改良的鞣酸染色法和透射電鏡鑒定細胞純度。
　　4.AQP-4大鼠肺泡組織及肺泡II型上皮細胞m-RNA表達的測定
　　免疫組織化學(xué)試劑盒進行肺組織AQP-4免疫組化染色；Trizol提取肺泡Ⅱ型上皮細胞總RNA，紫外線分光光度儀OD260檢測其含量。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測AQP-4mRNA的表達。采用Strom860圖像分析系統(tǒng)行密度掃描,計算AQP4產(chǎn)物與β-acti

6、n產(chǎn)物吸光度積分的比例，作為AQP4mRNA表達水平。
　　5.血管外肺水（EVLW）的測定
　　重力法測定EVLW。放血活殺切取完整肺組織,去除支氣管,通過檢測分布于肺血管外的液體，主要為細胞內(nèi)液、肺泡內(nèi)液和肺間質(zhì)液變化反映肺水腫的程度。根據(jù)公式計算EVLW含量。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠造模后的評價
　　油酸注入后大鼠均在30s-3min內(nèi)出現(xiàn)明顯呼吸加快,淺促,口唇皮膚以及四肢發(fā)紺,氣管插管內(nèi)分泌物明

7、顯增多的臨床表現(xiàn)。血氣分析PaCO2明顯上升，PO2下降，PaO2/FiO2值符合ALI的診斷標準。HE染色病理示肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有小量出血,可見炎性細胞增多；肺泡隔增寬,肺間質(zhì)滲液明顯。
　　2.大鼠ATⅡ細胞的分離純化方法的評價
　　經(jīng)臺盼蘭染色對照組細胞活力84.3±3.21％，油酸組83.7±2.96％(圖10-11)，電鏡下見細胞形態(tài)較規(guī)則,呈圓形或立方形,表面有很多長短不一的微絨毛,核圓形,胞質(zhì)著色淺，見特征性的嗜

8、鋨性板層小體(圖12)。ALI組電鏡下見細胞變性，細胞形態(tài)相對不規(guī)則,表面的微絨毛明顯減少,胞核變形,染色質(zhì)邊集,線粒體腫脹，胞漿內(nèi)各種細胞器明顯減少,板層小體排空顯著增多而致空泡化。
　　3.AQP4肺泡組織免疫組化染色及肺泡Ⅱ型上皮細胞的表達
　　正常組AQP4呈弱陽性染色,細胞偶被染成淡黃色(圖),主要分布肺泡上皮細胞形態(tài)較規(guī)則的細胞上，在ALI組AQP4呈陽性染色，棕黃陽性顆粒增多、染色強度變大。肺泡Ⅱ型細胞提取RN

9、A經(jīng)過RT-PCR擴增后，ALI組合成明顯增加。
　　4.特布他林治療后血氣分析、病理及血管外肺水（EVLW）含量變化
　　特布他林組血氣分析未達到ALI診斷的標準，PO2增高；病理Smith評分較模型組明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)意義；EVLW明顯小于模型組，明顯提高肺泡上皮液體清除。
　　5.特布他林對肺泡及肺泡II型上皮細胞AQP-4影響
　　特布他林組AQP4免疫組化呈強陽性表現(xiàn)，主要分布肺泡上皮細胞形態(tài)較規(guī)則的

10、細胞上（圖29、30）。肺泡II型上皮細胞擴增與對照組有顯著性差異，吸光度積分較模型組增加，但二者未有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　模型組血氣分析，肺部病理改變，上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)及EVLW嚴重程度顯著高于對照組，符合肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征的診斷標準，說明腹腔靜脈注射油酸建立大鼠ALI急性模型是一個相對簡單而成功率高的方法。
　　采用改良的胰酶消化法可以成功分離正常和油酸ALI大鼠的ATⅡ細胞，用大鼠IgG包被培養(yǎng)

11、皿純化細胞、鞣酸染色法鑒定細胞純度簡單可行，而透射電鏡是鑒定細胞的金標準。顯微鏡下肺泡Ⅱ型上皮細胞的數(shù)量較對照組無明顯減少，但電鏡下細胞的超微結(jié)構(gòu)如板層小體排空，線粒體損傷表現(xiàn)。
　　通過免疫組化證明AQP4存在于大鼠肺泡上皮，尤其II型細胞膜。RT-PCR顯示模型組ATⅡ細胞受損后，AQP4表達增高，說明其仍具有上調(diào)水通道蛋白轉(zhuǎn)運功能。氣道內(nèi)特布他林給藥，從肺臟大體、血氣分析、病理、肺泡II型上皮細胞電鏡下形態(tài)等結(jié)果達不到肺損傷