多巴胺D3受體對(duì)醛固酮介導(dǎo)的促血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用的影響及機(jī)制.pdf

1、一、研究背景：
　　高血壓(Essential Hypertension,EH)及其并發(fā)癥已成為影響人們健康的主要原因,高血壓同時(shí)是冠心病、腎衰竭、中風(fēng)等多種疾病的主要危險(xiǎn)因素,因此明確EH的發(fā)生、進(jìn)展機(jī)理對(duì)尋找有效的防治措施顯得尤其重要[1]。血壓長(zhǎng)期升高引起全身小動(dòng)脈血管重塑(vascular remodeling),表現(xiàn)為小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄,是高血壓導(dǎo)致心、腦、腎等靶器官損害的病理基礎(chǔ)[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系

2、統(tǒng)(Renin-AngiotensinⅡ-Aldosterone system,RAAS)異常激活在EH發(fā)生發(fā)展及血管重構(gòu)中的作用已得到人們公認(rèn)[3]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的異常增殖、遷移在血管重塑中扮演中心角色[4]。VSMCs的增殖、遷移受到了眾多神經(jīng)體液因子的調(diào)節(jié),其中RAAS的主要因子血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)的作用尤為重要,而RAAS的另

3、一重要成員醛固酮在心血管重塑中的作用亦逐漸受到重視[5,6]。研究發(fā)現(xiàn),醛固酮對(duì)血管壁有直接作用,作用于VSMCs,可以促進(jìn)其增殖、肥大、炎癥及衰老化改變[7]。醛固酮不僅對(duì)VSMCs有直接的促增殖作用[8],還能增強(qiáng)經(jīng)典的促增殖因子AngⅡ?qū)SMCs的促增殖作用[9]。醛固酮還可通過激活c-Src激酶途徑,增強(qiáng)AngⅡ介導(dǎo)的促VSMCs遷移效應(yīng)[10]。AngⅡ可刺激醛固酮的分泌,醛固酮反過來又可上調(diào)VSMCs上AngⅡ1型受體(A

4、T1R)的表達(dá)[11],醛固酮與AngⅡ之間的這種相互協(xié)同作用可能在血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[12]。
　　在過去20~30年,多巴胺及其受體在高血壓發(fā)生中的作用逐漸受到重視。多巴胺受體可分為D1類受體(包括D1和D5)和D2類受體(包括D2、D3、D4)兩大類共5種亞型,5種亞型受體中任何一種受體基因敲除的小鼠均發(fā)生高血壓[13]。多巴胺受體的5種亞型均直接或間接通過與其他血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)(如交感神經(jīng)系統(tǒng)、RAAS等)的交互作用,參與

5、對(duì)腎臟尿鈉排泄及血壓的調(diào)節(jié)[14]。作為D2類多巴胺受體的主要亞型,D3受體在腎臟以及動(dòng)脈血管壁各層均有表達(dá),在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[13]。D3受體基因敲除(D3-/-)小鼠發(fā)生腎素依賴性高血壓,腎臟腎素活性、AT1R蛋白表達(dá)均明顯升高[14]。而刺激D3受體可促進(jìn)尿鈉排泄,并減少腎臟組織腎素的生成、降低AT1R蛋白的表達(dá)[15],提示多巴胺D3受體與RAAS的相互作用可能在腎臟功能以及血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
　　刺激D3受

6、體在腎臟可產(chǎn)生利鈉排尿的作用,在血管刺激D3受體則可使苯腎上腺素或AngⅡ預(yù)先收縮的動(dòng)脈血管舒張[13]。我們既往的研究發(fā)現(xiàn),激動(dòng)多巴胺D3受體能夠抑制去甲腎上腺素[16]、胰島素[17]介導(dǎo)的促VSMCs增殖效應(yīng),激動(dòng)多巴胺D3受體還能夠抑制神經(jīng)肽-Y介導(dǎo)的促VSMCs遷移效應(yīng)。RAAS在高血壓血管重構(gòu)中的作用已得到公認(rèn),AngⅡ介導(dǎo)促VSMCs增殖、遷移效應(yīng),而醛固酮除自身有直接的促VSMCs增殖作用外,還能增強(qiáng)AngⅡ?qū)SMCs

7、的促增殖、遷移作用,其與AngⅡ之間的這種協(xié)同作用在血管重構(gòu)中的作用是近年來研究熱點(diǎn)[12]。在腎臟,多巴胺D3受體與RAAS間通過一種負(fù)性相互作用在調(diào)節(jié)水鈉排泄中發(fā)揮相反的作用[15],那么它們?cè)谘鼙谑欠翊嬖陬愃频南嗷プ饔媚?多巴胺D3受體對(duì)醛固酮以及AngⅡ在VSMCs上的促增殖、遷移效應(yīng)是否存在影響?結(jié)合我們既往的研究,我們推測(cè):多巴胺D3受體對(duì)醛固酮以及AngⅡ介導(dǎo)的促VSMCs增殖、遷移作用具有調(diào)節(jié)作用,這種調(diào)節(jié)作用可能參與

8、了高血壓血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。
　　二、研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過觀察A10細(xì)胞(大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株)在醛固酮、AngⅡ、多巴胺D3受體激動(dòng)劑共同刺激的情況下,A10細(xì)胞增殖、遷移的變化情況,了解D3受體是否通過對(duì)醛固酮以及AngⅡ介導(dǎo)的促VSMCs增殖、遷移作用發(fā)揮影響,了解D3受體與RAAS在高血壓血管重塑過程中的相互作用。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1.A10細(xì)胞的培養(yǎng),采用不同濃度的醛固酮作用于A10細(xì)胞,

9、觀察醛固酮對(duì)A10細(xì)胞增殖的影響。
　　2.用不同濃度的多巴胺D3受體激動(dòng)劑PD128907作用于A10細(xì)胞,觀察單純激動(dòng)多巴胺D3受體對(duì)A10細(xì)胞增殖的影響。進(jìn)一步觀察PD128907預(yù)先刺激的情況下,醛固酮對(duì)A10細(xì)胞增殖的作用的變化。
　　3.觀察醛固酮刺激對(duì)A10細(xì)胞的磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表達(dá)的影響,以及在PD128907預(yù)先激動(dòng)多巴胺D3受體的情況下,該作用的變化。探討激動(dòng)多巴胺D3受體對(duì)醛固酮促

10、A10細(xì)胞增殖效應(yīng)發(fā)生影響的具體機(jī)制。
　　4.觀察AngⅡ?qū)10細(xì)胞遷移的影響,以及在不同濃度醛固酮及AngⅡ(醛固酮/AngⅡ)共同刺激情況下,A10細(xì)胞遷移作用的變化。用不同濃度的PD128907作用于A10細(xì)胞,觀察單純激動(dòng)多巴胺D3受體對(duì)VSMCs遷移的影響。
　　5.觀察PD128907預(yù)先刺激的情況下,醛固酮/AngⅡ?qū)SMCs遷移效應(yīng)的變化。如果激動(dòng)多巴胺D3受體能影響醛固酮/AngⅡ促VSMCs遷移效應(yīng)

11、,進(jìn)一步研究其具體機(jī)制。
　　三、研究方法：
　　1.A10細(xì)胞(胚胎大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株)的傳代培養(yǎng)。
　　2.細(xì)胞增殖檢測(cè)的方法采用[3H]-TdR摻入法、CCK-8、細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。
　　3.細(xì)胞遷移檢測(cè)的方法采用細(xì)胞遷移Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)。
　　4.細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blot方法。
　　四、研究結(jié)果：
　　1.醛固酮刺激濃度依賴性地促進(jìn)A10細(xì)胞

12、增殖。單純激動(dòng)多巴胺D3受體對(duì)A10細(xì)胞增殖無明顯影響,但激動(dòng)多巴胺D3受體可顯著降低醛固酮促A10細(xì)胞增殖的作用,且該作用呈濃度依賴性。
　　2.醛固酮刺激A10細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)上升,而激動(dòng)多巴胺D3受體抑制了醛固酮的這種作用。
　　3.AngⅡ濃度依賴性地促進(jìn)A10細(xì)胞遷移。低濃度醛固酮刺激本身對(duì)細(xì)胞遷移沒有影響,但是可以顯著增強(qiáng)低濃度AngⅡ的促A10細(xì)胞遷移作用。氯沙坦及螺內(nèi)酯均可阻斷這種協(xié)同促遷移作用。

13、r>　　4.刺激多巴胺D3受體本身對(duì)A10細(xì)胞遷移沒有影響,但可濃度依賴性地抑制低濃度醛固酮/AngⅡ協(xié)同促A10細(xì)胞遷移作用。PKA抑制劑阻斷了刺激多巴胺D3受體對(duì)醛固酮/AngⅡ協(xié)同促遷移效應(yīng)的抑制作用。
　　五、結(jié)論：
　　激動(dòng)多巴胺D3受體下調(diào)p-ERK1/2的表達(dá),抑制了醛固酮促進(jìn)A10細(xì)胞增殖的作用。激動(dòng)多巴胺D3受體通過激活PKA抑制了醛固酮/AngⅡ促A10細(xì)胞遷移的作用。多巴胺D3受體與RAAS之間的相互作