SA-hGM-CSF雙功能融合蛋白的制備及其生物學功能研究.pdf

1、研究背景:
　　 惡性腫瘤是危害人類生命的重大疾病，近幾年來發(fā)病率一直在持續(xù)上升，如何克服腫瘤這個難關成為人們研究的熱點。手術、放療和化療作為傳統(tǒng)的三大治療方法，雖然對腫瘤有一定的治療作用，但是仍存在很多的不足:如放療和化療缺乏腫瘤特異性，對正常組織細胞損傷大，毒副作用大，復發(fā)率高，不能從本質上根治腫瘤等。因此，尋找高效無毒副作用，能夠誘導長期免疫保護作用，防止術后復發(fā)的的新療法及新型藥物成為臨床腫瘤治療中迫切需要解決的問題。<

2、br>　　 目前腫瘤治療的難點是腫瘤術后的高復發(fā)率，如何才能預防或降低復發(fā)率成為人們研究的重點。腫瘤的生物治療在動物實驗和臨床試驗中顯示了巨大的潛力，被認為是繼手術、放療、化療之后，對腫瘤具有確切效果的又一治療方法。它主要包括腫瘤特異性主動免疫治療、抗體靶向治療、細胞因子治療、過繼細胞免疫治療和基因治療，而細胞因子在腫瘤生物治療中應用非常廣泛。
　　 細胞因子是由免疫細胞分泌的一大類的蛋白、多肽和糖蛋白，它能夠調節(jié)機體免疫反應

3、，增強淋巴細胞對腫瘤的殺傷，從而達到抑制腫瘤生長的目的，被廣泛應用于臨床腫瘤疾病的治療。
　　 由于全身用藥量大，會產生嚴重的毒副作用，因此臨床上多采用局部用藥。但是因為組織的彌散作用，代謝較快，病灶周圍細胞因子在局部不能達到有效濃度并較長時間的維持，因此限制了其抗腫瘤的效果。
　　 鏈親和素(SA)，是由Streptomyces avidinii菌分泌的的一種非糖基化的蛋白質，每個SA分子可以結合4個生物素分子。生物素

4、又稱維生素H，細胞表面蛋白質的氨基易生物素化，而生物素化對機體和細胞無明顯毒副作用。基于鏈親和素與生物素化的分子快速且?guī)缀醪豢赡娴膹娏Y合，以及生物素較容易滲入各種生物分子的特性，我們建立了一個新的技術平臺——蛋白質錨定技術，即將鏈親和素標記的細胞因子錨定在已經生物素化的腫瘤細胞表面，從而制成了腫瘤疫苗。先用生物素化試劑將生物素化學交聯(lián)到腫瘤細胞或組織表面的膜蛋白上，然后將鏈親和素標記的目標蛋白即雙功能分子借助鏈親和素與生物素的特異結合

5、將目標蛋白錨定在腫瘤細胞膜或腫瘤組織表面，其中生物素化反應對細胞、組織和機體無明顯的不良作用，這種技術可以使融合蛋白在體內對腫瘤組織進行快速原位修飾，迅速永久地固定在腫瘤病灶及其周圍，固定的量可以進行精確的控制，可持續(xù)維持細胞因子在腫瘤細胞膜上及其腫瘤組織中的有效治療濃度，并避免大量細胞因子進入循環(huán)系統(tǒng)引起的嚴重的毒副作用。
　　 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種造血生長因子和免疫調節(jié)因子，由多種類型細胞產生，

6、包括巨噬細胞、內皮細胞、肥大細胞以及活化的CD4+、CD8+細胞。它是一種能夠強烈刺激巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原呈遞細胞的增殖、分化、活化、成熟和趨化的細胞因子，還能夠增加主要組織相容性復合物、共刺激分子的表達并增強樹突狀細胞的抗腫瘤能力。它通過促進抗原提呈來建立固有免疫和適應性免疫之間的聯(lián)系，進而增強特異性免疫應答。
　　 本室先前的實驗表明:鏈親和素標記的鼠GM-CSF融合蛋白制成的腫瘤疫苗在鼠的淺表膀胱癌以及前列腺癌動物模

7、型中，有效緩解了細胞因子的降解，維持了細胞因子的濃度，起到了很好的抗腫瘤效應。但是由于人和鼠具有種系差異性，因此，對人的GM-CSF需要做進一步的研究。
　　 本文構建了SA/hGM-CSF原核表達質粒，在大腸桿菌中實現了高效表達，對SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的純化與復性進行了研究，并對其雙功能活性進行了初步鑒定，為以后SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白在臨床抗腫瘤的大量應用奠定了基礎。
　　 研究目的:

8、　　 構建SA/hGM-CSF重組表達質粒，表達純化SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白，并研究其生物學功能。
　　 研究方法:
　　 1.構建SA/hGM-CSF重組表達質粒
　　 應用PCR方法擴增hGM-CSF目的片段，產物經雙酶切并純化回收，然后與本室保存的pET24a-SA載體連接。獲得pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA原核表達質粒，經菌落PCR及雙酶切初步鑒定后，送

9、公司測序以充分驗證基因框架的正確。
　　 2.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的表達純化
　　 探索出SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的最佳誘導條件（誘導時間，誘導溫度等）。大量擴增細菌并收集菌體，通過12％SDS-PAGE凝膠來確定融合蛋白是在包涵體還是在上清中表達。在包涵體表達的蛋白純化之前需要在變性劑（如鹽酸胍，尿素等）的作用下，充分溶解。由于融合蛋白帶有His標簽，因此利用Ni-NTA填料來純化蛋白。利用不同

10、濃度的咪唑磷酸鹽緩沖液，從低濃度到高濃度依次洗脫蛋白，收集洗脫峰，經12％SDS-PAGE凝膠鑒定，目的蛋白在何種濃度的咪唑磷酸鹽緩沖液中被洗脫下來。
　　 3.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的復性
　　 SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白在尿素體系中采用梯度稀釋法復性，逐漸降低尿素濃度。復性過程中形成中間體和多聚體是蛋白質復性的最大問題所在，中間體阻礙作用大，蛋白質正確折疊困難，復性就困難。降低蛋白質的濃度可以減少

11、中間體的形成并且提高復性效率。在蛋白質中加入50mmol/L的β-巰基乙醇，以充分打開蛋白質的二硫鍵。為了促使二硫鍵的形成，在復性液中加入了還原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽，提高蛋白的復性率。
　　 4.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的進一步純化
　　 利用DEAE-Sepharose FF對復性后SA/ hGM-CSF融合蛋白進行離子交換層析純化，利用不同濃度的NaCl的Tris-HCl緩沖液，從低濃度到高濃度依次洗

12、脫蛋白，收集洗脫峰，經12％SDS-PAGE凝膠鑒定，目的蛋白在何種濃度的NaCl的Tris-HCl緩沖液中被洗脫下來。
　　 5.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的Western Blotting鑒定
　　 10％ SDS-PAGE電泳分離蛋白，利用半干電轉儀將蛋白轉移至PVDF膜上。用5％的脫脂奶粉于37℃封閉3h后，加入1:2000封閉液稀釋的鼠抗人GM-CSF單克隆抗體4℃孵育12h，TBST洗滌3次，加入偶聯(lián)

13、辣根過氧化物酶的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋）37℃孵育1h，TBST洗滌后用ECL曝光。
　　 6.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的活性鑒定
　　 hGM-CSF可以在體外促進人紅白血病細胞的增殖，利用體外促人紅白血病細胞增殖法檢測融合蛋白的活性，并與標準品比較活性是否有差異。通過與標準品的比較獲得所制備的SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的活性單位。
　　 7.流式細胞儀檢測SA/hGM-CSF雙功

14、能融合蛋白的錨定率
　　 生物素化腫瘤細胞，將SA/hGM-CSF融合蛋白錨定到已生物素化的腫瘤細胞表面，加入鼠抗人GM-CSF單克隆抗體（一抗），充分反應后，加入FITC標記的羊抗鼠IgG(二抗)，充分洗滌后，上機檢測，分析SA/hGM-CSF對腫瘤細胞的錨定修飾結果。
　　 研究結果:
　　 1.成功構建pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA重組質粒。重組質粒進行DNA測序，結

15、果與GenBank收錄的SA和和hGM-CSF序列完全一致，基因讀碼框架正確。
　　 2.將測序正確的質粒轉化大腸桿菌Rosetta，經篩選獲得表達工程菌，培養(yǎng)后在37℃，IPTG誘導4h，目的蛋白的表達量占總蛋白表達量的20％，主要以包涵體形式表達。包涵體首先用6mol/L鹽酸胍溶解，在鹽酸胍完全溶解后再用6mol/L尿素磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，提高融合蛋白回收率。經洗滌后，融合蛋白的純度達到65％，鎳金屬螯合層析后，經12％

16、SDS-PAGE凝膠鑒定，SA-hGM-CSF及hGM-CSF-SA兩種融合蛋白分別在30mmol/L、50mmol/L咪唑濃度洗脫下來，純度達到91％。
　　 3.復性后SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白主要以多聚體的形式存在，且復性過程中形成的沉淀較少。
　　 4.復性后的融合蛋白用DEAE-Seperose層析柱純化，分別用30mmol/L、50mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mm

17、ol/L、500 mmol/L、1mmol/L NaCl洗脫液洗脫蛋白。SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白在200 mmol/L NaCl濃度洗脫下來，純度達到96％。
　　 5.Western Blotting結果證明SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白單體與多聚體均能與GM-CSF單克隆抗體結合，并發(fā)生顯色反應。
　　 6.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白能夠促進人紅白血病細胞增殖，呈劑量依賴關系。SA/hGM-CS

18、F雙功能融合蛋白的活性和hGM-CSF標準品無明顯差別。經比較分析，發(fā)現SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA的生物學活性無明顯差別。
　　 7.流式細胞儀檢測SA-hGM-CSF及hGM-CSF-SA雙功能融合蛋白的腫瘤細胞錨定率，錨定率為99.94％、99.98％。
　　 研究結論:
　　 1.成功構建了pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA重組表達質粒。
　　 2