磷酸鈣陶瓷表面微納結(jié)構(gòu)的制備及其生物學功能研究.pdf

1、磷酸鈣作為骨組織的主要無機成分，能與活體組織形成化學性鍵合，具有優(yōu)良的骨傳導性和骨誘導性，是目前學術(shù)界公認的適用于臨床應(yīng)用的生物活性陶瓷材料。生物材料植入體內(nèi)后其表面與生物環(huán)境直接接觸，因此材料表面與細胞的相互作用是生物材料成功應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。越來越多的研究表明生物材料表面的微納結(jié)構(gòu)能夠有效調(diào)控細胞的粘附、伸展、增殖和分化。基于此，本研究旨在羥基磷灰石陶瓷表面制備不同的微納結(jié)構(gòu)，研究表面微納結(jié)構(gòu)化磷酸鈣陶瓷的骨誘導性及其成骨作用機制

2、。
　　本文首先利用RNA-seq技術(shù)系統(tǒng)研究鈣離子對于間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響及作用機制;之后使用分子對接技術(shù)研究羥基磷灰石分子與細胞外基質(zhì)蛋白纖粘連蛋白(FN)的相互作用機制，對羥基磷灰石陶瓷生物相容性及成骨誘導特性機制進行探討;在此基礎(chǔ)上，為提高羥基磷灰石支架的生物活性特別是成骨誘導能力，采用水熱合成和機械處理的方法制備了具有不同表面微納結(jié)構(gòu)的羥基磷灰石陶瓷，對其進行表征和生物學功能檢測，最后對其表面微納結(jié)構(gòu)作用機制進行分

3、析推測。主要內(nèi)容及結(jié)果歸納如下:
　　將大鼠BMSC培養(yǎng)在10mM鈣離子DMEM培養(yǎng)基中，分別對1、4、7天后的細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序（以正常培養(yǎng)基做對照）。利用Tophat軟件對測序結(jié)果進行基因組比對，Cufflinks軟件進行轉(zhuǎn)錄本組裝以及差異表達基因搜索，最后使用網(wǎng)絡(luò)分析工具DAVID進行差異表達基因的歸類、注釋及功能分析。結(jié)果表明，鈣離子促進了BMP2基因的表達，同時抑制了BMP通道阻抑蛋白BMPer的表達;對于ERRR，WN

4、T和TGF-β等其它成骨誘導相關(guān)信號通道分析表明，信號通道激活蛋白表達減少而阻抑蛋白表達增多。
　　其次，利用Auto DOCK軟件分析羥基磷灰石分子與FN部分片段(FN-Ⅲ7-10)之間的相互作用。結(jié)果表明羥基磷灰石分子與FN-Ⅲ7-10的結(jié)合位點主要位于RGD區(qū)域所在的片段，并且此片段對于相鄰片段與羥基磷灰石分子的結(jié)合有促進作用。羥基磷灰石分子與FN-Ⅲ7-10的結(jié)合位點主要位于RGD肽段的一側(cè)，不會影響FN-Ⅲ7-10與細胞

5、表面受體的結(jié)合;羥基磷灰石分子與FN-Ⅲ7-10的結(jié)合位點處精氨酸出現(xiàn)的頻率高。這從理論上闡述了羥基磷灰石良好生物相容性的分子機制。
　　接著，使用鈣磷鹽將羥基磷灰石陶瓷支架進行浸漬處理，增加表面鈣磷成核位點，加入肌醇六磷酸(IP6)，150℃反應(yīng)3h制備不同微納結(jié)構(gòu)磷酸鈣涂層。結(jié)果表明IP6調(diào)控磷酸鈣在支架表面沉積，形成長橢球狀顆粒組成微納結(jié)構(gòu);如水熱反應(yīng)中無IP6，則支架表面形成六棱柱狀微納結(jié)構(gòu)，涂層厚度小。鈣離子釋放實驗表明

6、，橢球狀磷酸鈣涂層支架鈣離子釋放速度快，釋放量多;體外實驗表明，不同表面微納結(jié)構(gòu)支架都具有良好的生物相容性，橢球狀磷酸鈣涂層更加有利于間充質(zhì)干細胞(MSC)的成骨分化，其中BMP2和YAP/TAZ扮演著重要的角色。
　　最后利用打磨拋光方法在三種不同工藝制備的羥基磷灰石陶瓷表面制備微孔結(jié)構(gòu)，通過掃描電子顯微鏡(SEM)，X射線衍射儀(XRD)，輪廓儀等對表面微孔進行表征。結(jié)果表明，經(jīng)機械研磨后，致密羥基磷灰石陶瓷表面形成大量微納米

7、級凹孔，平均內(nèi)徑分別是0.8577μm和1.1406μm。FN蛋白吸附實驗表明羥基磷灰石陶瓷表面微孔結(jié)構(gòu)影響了蛋白吸附。此外，分別在細胞與分子水平上通過免疫熒光染色、堿性磷酸酶(ALP)活性檢測、以及成骨相關(guān)基因的RT-PCR檢測表明，材料表面微孔結(jié)構(gòu)化羥基磷灰石陶瓷細胞粘附及增殖無顯著差異，細胞形貌具有明顯不同，ALP活性有少量的差別;成骨分化相關(guān)基因的表達也有較小的差異。
　　綜上所述，磷酸鈣陶瓷表面的微納結(jié)構(gòu)通過調(diào)控蛋白的吸