FILIP-1L蛋白抗體制備及其生物學(xué)功能檢測(cè).pdf

1、背景:
　　 肝細(xì)胞癌是一種全球常見的高致死率肝臟病變，它也是我國主要高發(fā)和高致死性癌癥之一。臨床和實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果表明，HBV，HCV感染誘導(dǎo)的慢性肝病和肝硬化，黃曲霉毒素和其它致癌化合物污染食品，基因突變等是誘發(fā)肝癌的主要病因。它們通過誘導(dǎo)激活多個(gè)肝細(xì)胞基因的異常表達(dá)而促使肝細(xì)胞癌變，如c-myc、pRB，p53和熱休克蛋白等。
　　 熱休克蛋白不僅能調(diào)節(jié)正常細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，而且還參與調(diào)控多種組織器官癌癥(包括肝細(xì)胞癌)的

2、發(fā)生、轉(zhuǎn)移和藥物耐受。Hsf1是調(diào)控?zé)嵝菘说鞍妆磉_(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，它對(duì)一些特異組織的腫瘤發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。如Hsf1在肝癌病人組織中表達(dá)升高。敲除小鼠Hsf1能抑制DMBP，誘導(dǎo)的皮膚癌，突變P53誘發(fā)的淋巴癌和DEN誘導(dǎo)的肝癌。而Hsf1調(diào)控肝癌發(fā)生的分子機(jī)理還在研究中。近期報(bào)道Hsf1能與FILIP-1L(FilaminAinteractingprotein1-like，alsoknownasdown-regulatedino

3、variancancer1，Doc1)結(jié)合。FILIP-1L能抑制Hsf1蛋白表達(dá)和Hsf1介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)。目前對(duì)FILIP-1L基礎(chǔ)生物功能的研究還很局限。FILIP-1L主要表達(dá)在不同的上皮組織中。它在卵巢癌細(xì)胞系，卵巢癌上皮、HPV16E7永生化的前列腺上皮中表達(dá)量降低，參與抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移調(diào)控。因此，認(rèn)為FILIP-1L具有抑癌基因的潛在功能，而這方面還需更多的研究資料支持。FILIP-1L在肝癌發(fā)生，發(fā)展中的作用還沒有研究

4、和報(bào)道，該課題將以肝癌細(xì)胞系和病人肝癌組織為材料，探討FILIP-1L在肝癌發(fā)生中的作用。
　　 目的:
　　 研究FILIP-1L在肝癌中的表達(dá)及生物學(xué)作用，探討FILIP-1L相互作用的蛋白及功能。
　　 方法:
　　 1，制備FILIP-1L抗體：將已構(gòu)建好的質(zhì)粒pGEX-4T3-FILIP-1L，轉(zhuǎn)化受體菌E.coliBL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-FILIP-1L(1-288)融合蛋白，采用

5、GST親和純化方法，純化GST-FILIP-1L(1-288)融合蛋白。將融合蛋白免疫動(dòng)物，制備FILIP-1L多克隆抗體，然后利用硫酸銨沉淀法和親和層析技術(shù)純化抗體，鑒別抗體特異性；2，利用RT-PCR技術(shù)及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞系中FILIP-1L基因及蛋白的表達(dá)；3，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立過表達(dá)和沉默F(xiàn)ILIP-1L的肝癌細(xì)胞株，利用MTT法、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)FILIP-1L對(duì)肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5

6、的生長(zhǎng)、遷移和成瘤性的影響；4，利用免疫共沉淀技術(shù)，研究FILIP-1L和Rb之間的相互結(jié)合及對(duì)抑癌的作用機(jī)理。
　　 結(jié)果:
　　 利用受體菌E.coliBL21，成功誘導(dǎo)表達(dá)出GST-FILIP-1L(1-288)融合蛋白，免疫動(dòng)物后獲得高效價(jià)多克隆抗體。RT-PCR及免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同肝癌細(xì)胞系均有FILIP-1L基因和蛋白的表達(dá)，且FILIP-1L蛋白在肝癌組織的表達(dá)量高于癌旁組織。成功建立過表達(dá)及沉默F(xiàn)IL

7、IP-1L的肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5，經(jīng)MTT、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空載體對(duì)照肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5比較，過表達(dá)FILIP-1L的肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5的生長(zhǎng)速度減慢、相對(duì)遷移距離變小、軟瓊脂克隆形成數(shù)減少；而沉默F(xiàn)ILIP-1L的肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5生長(zhǎng)速度增快、相對(duì)遷移距離增長(zhǎng)、軟瓊脂克隆形成數(shù)增多。免疫印跡結(jié)果顯示，過表達(dá)FILIP-1L的肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5及人胚腎細(xì)胞株293T中Rb

8、蛋白的表達(dá)量減少，而沉默F(xiàn)ILIP-1L的肝癌細(xì)胞株Rb蛋白表達(dá)量增高。免疫共沉淀結(jié)果顯示，在肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5內(nèi)，Rb與FILIP-1L相互結(jié)合。
　　 結(jié)論:
　　 獲得了GST-FILIP-1L(1-288)融合蛋白，制備了FILIP-1L的多克隆抗體。不同的肝癌細(xì)胞系和肝癌組織中均有FILIP-1L表達(dá)。FILIP-1L能抑制肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5的生長(zhǎng)、遷移和成瘤性。在肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/