SA-hGM-CSF雙功能融合蛋白的制備及生物學(xué)功能鑒定.pdf

1、目的:本文將已構(gòu)建好的SA-hGM-CSF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)、通過采用發(fā)酵罐發(fā)酵，Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析純化、尿素梯度透析復(fù)性等方法，制備出鏈親和素標(biāo)記hGM-CSF的融合蛋白，并研究其生物學(xué)功能以及一級結(jié)構(gòu)，為后期的動物實驗及腫瘤疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.誘導(dǎo)表達(dá)SA-hGM-CSF融合蛋白將已建好的SA-hGM-CSF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到用CaCl2方法制備的Rosetta感受態(tài)細(xì)胞

2、中進(jìn)行過夜活化，挑單克隆菌落，篩選出高表達(dá)菌株，二次活化，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，高壓破碎儀破菌，采用本實驗室已成功研制的包涵體洗滌方法洗滌包涵體。用SDS-PAGE分析檢測上清及包涵體表達(dá)產(chǎn)物。
　　 2.SA-hGM-CSF融合蛋白的發(fā)酵發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程，選擇優(yōu)良的菌株是發(fā)酵的第一步，菌體的性質(zhì)影響其生長和產(chǎn)物的表達(dá)，根據(jù)Rosetta細(xì)菌的性質(zhì)將發(fā)酵培養(yǎng)基的成分進(jìn)行優(yōu)化分析，并對接種量，培養(yǎng)基的pH值，IPTG誘導(dǎo)濃度及時間

3、進(jìn)行優(yōu)化。通過發(fā)酵系統(tǒng)對整個發(fā)酵過程（溫度，pH，溶氧量）進(jìn)行監(jiān)控。
　　 3.SA-hGM-CS融合蛋白的純化與復(fù)性工程菌收集，通過高壓破碎儀破菌收得包涵體后，洗滌后的包涵體用6M鹽酸胍溶解，再用平衡液稀釋1倍，進(jìn)行鎳柱親和層析和凝膠過濾層析純化得到融合蛋白，將融合蛋白進(jìn)行透析復(fù)性。
　　 4.細(xì)胞錨定和實驗細(xì)胞增殖實驗將復(fù)性的SA-hGM-CSF融合蛋白稀釋成不同的濃度，體外檢測是否對TF-1細(xì)胞有增殖效應(yīng)，應(yīng)用流式

4、細(xì)胞儀檢測SA-hGM-CSF融合蛋白對已生物素化的前列腺癌細(xì)胞的錨定率。
　　 5.一級結(jié)構(gòu)的測定通過SDS-PAGE，膠內(nèi)酶切得到樣品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定SA-hGM-CSF融合蛋的分子量。
　　 結(jié)果:
　　 1.誘導(dǎo)表達(dá)SA-hGM-CSF融合蛋白將重組質(zhì)粒SA-hGM-CSF轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)篩選后獲得高表達(dá)工程菌，SDS-PAGE顯示，融合蛋白分子量的位置大約在36KD左右。IPTG誘導(dǎo)的最佳終濃度0.3mmo

5、l/L，誘導(dǎo)時間4h，蛋白以包涵體形式表達(dá)。
　　 2.SA-hGM-CSF融合蛋白的發(fā)酵使用優(yōu)化的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO44.0 g/L,Na2HPO45 g/L,MgSO40.6 g/L，甘油(5％)50ml/L,NH4CL0.4g/L，在1∶50的接種量，pH值為7.0，溶氧30％的條件下一次性可得到濕菌140g和包涵體85g。
　　 3.SA

6、-hGM-CS融合蛋白的純化與復(fù)性洗滌后的包涵體用6M鹽酸胍溶解，經(jīng)鎳柱親和層析和凝膠過濾層析純化后，用凝膠掃描儀檢測其純度為97％，透析復(fù)性后融合蛋白主要以多聚體形式存在。
　　 4.細(xì)胞錨定和細(xì)胞增殖實驗將復(fù)性的SA-hGM-CSF融合蛋白調(diào)整不同濃度，用CCK8法發(fā)現(xiàn)從0.01-156.25ng/ml不同濃度的SA-hGM-CSF有增殖TF-1細(xì)胞的活性且成劑量依賴效應(yīng);流式細(xì)胞儀檢測SA-hGM-CSF融合蛋白與經(jīng)生物素

7、化的前列腺癌細(xì)胞錨定率達(dá)到94.9％。
　　 5.一級結(jié)構(gòu)的測定將已酶切好的SA-hGM-CSF融合蛋白，應(yīng)用ESI-Ion trap質(zhì)譜檢測SA-hGM-CSF融合蛋白分子量，其分子量為35922D。
　　 結(jié)論:本文成功的將質(zhì)粒SA-hGM-CSF導(dǎo)入大腸桿菌中并通過誘導(dǎo)表達(dá)方法獲得大量工程菌和包涵體，通過鎳柱親和層析和凝膠過濾層析純化后，透析復(fù)性獲得高純度和高濃度的融合蛋白，在體外細(xì)胞增殖實驗中初步檢測SA-hGM