2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩64頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:本文將已構(gòu)建好的SA-hGM-CSF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)、通過采用發(fā)酵罐發(fā)酵,Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析純化、尿素梯度透析復(fù)性等方法,制備出鏈親和素標(biāo)記hGM-CSF的融合蛋白,并研究其生物學(xué)功能以及一級結(jié)構(gòu),為后期的動物實驗及腫瘤疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
   方法:
   1.誘導(dǎo)表達(dá)SA-hGM-CSF融合蛋白將已建好的SA-hGM-CSF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到用CaCl2方法制備的Rosetta感受態(tài)細(xì)胞

2、中進(jìn)行過夜活化,挑單克隆菌落,篩選出高表達(dá)菌株,二次活化,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),高壓破碎儀破菌,采用本實驗室已成功研制的包涵體洗滌方法洗滌包涵體。用SDS-PAGE分析檢測上清及包涵體表達(dá)產(chǎn)物。
   2.SA-hGM-CSF融合蛋白的發(fā)酵發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程,選擇優(yōu)良的菌株是發(fā)酵的第一步,菌體的性質(zhì)影響其生長和產(chǎn)物的表達(dá),根據(jù)Rosetta細(xì)菌的性質(zhì)將發(fā)酵培養(yǎng)基的成分進(jìn)行優(yōu)化分析,并對接種量,培養(yǎng)基的pH值,IPTG誘導(dǎo)濃度及時間

3、進(jìn)行優(yōu)化。通過發(fā)酵系統(tǒng)對整個發(fā)酵過程(溫度,pH,溶氧量)進(jìn)行監(jiān)控。
   3.SA-hGM-CS融合蛋白的純化與復(fù)性工程菌收集,通過高壓破碎儀破菌收得包涵體后,洗滌后的包涵體用6M鹽酸胍溶解,再用平衡液稀釋1倍,進(jìn)行鎳柱親和層析和凝膠過濾層析純化得到融合蛋白,將融合蛋白進(jìn)行透析復(fù)性。
   4.細(xì)胞錨定和實驗細(xì)胞增殖實驗將復(fù)性的SA-hGM-CSF融合蛋白稀釋成不同的濃度,體外檢測是否對TF-1細(xì)胞有增殖效應(yīng),應(yīng)用流式

4、細(xì)胞儀檢測SA-hGM-CSF融合蛋白對已生物素化的前列腺癌細(xì)胞的錨定率。
   5.一級結(jié)構(gòu)的測定通過SDS-PAGE,膠內(nèi)酶切得到樣品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定SA-hGM-CSF融合蛋的分子量。
   結(jié)果:
   1.誘導(dǎo)表達(dá)SA-hGM-CSF融合蛋白將重組質(zhì)粒SA-hGM-CSF轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)篩選后獲得高表達(dá)工程菌,SDS-PAGE顯示,融合蛋白分子量的位置大約在36KD左右。IPTG誘導(dǎo)的最佳終濃度0.3mmo

5、l/L,誘導(dǎo)時間4h,蛋白以包涵體形式表達(dá)。
   2.SA-hGM-CSF融合蛋白的發(fā)酵使用優(yōu)化的培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,K2HPO41.5 g/L,KH2PO44.0 g/L,Na2HPO45 g/L,MgSO40.6 g/L,甘油(5%)50ml/L,NH4CL0.4g/L,在1∶50的接種量,pH值為7.0,溶氧30%的條件下一次性可得到濕菌140g和包涵體85g。
   3.SA

6、-hGM-CS融合蛋白的純化與復(fù)性洗滌后的包涵體用6M鹽酸胍溶解,經(jīng)鎳柱親和層析和凝膠過濾層析純化后,用凝膠掃描儀檢測其純度為97%,透析復(fù)性后融合蛋白主要以多聚體形式存在。
   4.細(xì)胞錨定和細(xì)胞增殖實驗將復(fù)性的SA-hGM-CSF融合蛋白調(diào)整不同濃度,用CCK8法發(fā)現(xiàn)從0.01-156.25ng/ml不同濃度的SA-hGM-CSF有增殖TF-1細(xì)胞的活性且成劑量依賴效應(yīng);流式細(xì)胞儀檢測SA-hGM-CSF融合蛋白與經(jīng)生物素

7、化的前列腺癌細(xì)胞錨定率達(dá)到94.9%。
   5.一級結(jié)構(gòu)的測定將已酶切好的SA-hGM-CSF融合蛋白,應(yīng)用ESI-Ion trap質(zhì)譜檢測SA-hGM-CSF融合蛋白分子量,其分子量為35922D。
   結(jié)論:本文成功的將質(zhì)粒SA-hGM-CSF導(dǎo)入大腸桿菌中并通過誘導(dǎo)表達(dá)方法獲得大量工程菌和包涵體,通過鎳柱親和層析和凝膠過濾層析純化后,透析復(fù)性獲得高純度和高濃度的融合蛋白,在體外細(xì)胞增殖實驗中初步檢測SA-hGM

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論