sTNFRⅡ-adiponectin融合蛋白的制備及其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　本課題通過對(duì)中國(guó)專利（專利號(hào)ZL200510100468.9）中的融合蛋白人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ胞外區(qū)與人脂聯(lián)素球部的融合基因（sTNFRⅡ-gAD）進(jìn)行改造，旨在構(gòu)建一種新型的雙功能融合蛋白，即可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素融合蛋白即sTNFRⅡ-adiponectin。該蛋白利用脂聯(lián)素能自發(fā)形成同源三聚體的特性，增加了腫瘤壞死因子受體Ⅱ與TNFα的親和力，并通過利用富含“GC”的載體系統(tǒng)高效表達(dá)蛋白，同時(shí)還探

2、索了無血清懸浮流加培養(yǎng)的方法，為高效、快速獲取該融合蛋白的大規(guī)模懸浮流加培養(yǎng)工藝奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1. 獲取sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因
　　通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，從人脂肪組織中獲取脂聯(lián)素cDNA。以該基因?yàn)槟０?，分別得到野生型和突變型adiponectin。再以實(shí)驗(yàn)室之前得到的pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc為模版，擴(kuò)增sT

3、NFRⅡ，將兩者融合，得到sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因。
　　2. 構(gòu)建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-MT表達(dá)質(zhì)粒
　　PCR擴(kuò)增目的基因sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNF

4、RⅡ-adiponectin-MT,構(gòu)建PMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，提質(zhì)粒得到大量sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT目的基因，將其酶切后分別連入PMH3、PCA表達(dá)載體，得到PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、 PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adipo

5、nectin-MT表達(dá)質(zhì)粒。
　　3. 建立表達(dá)sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白的高表達(dá)CHO細(xì)胞株
　　通過電轉(zhuǎn)化的方法，將成功構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入CHO-S細(xì)胞，經(jīng)過篩選得到高表達(dá)sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白的細(xì)胞株。
　　4. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-ad

6、iponectin-MT融合蛋白的獲取
　　4.1 貼壁培養(yǎng)
　　篩選出的高表達(dá)株于T75中貼壁培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清，利用鎳柱純化獲取目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT，透析過夜后超濾管濃縮蛋白，并通過Western-blot、考馬斯亮藍(lán)染色法鑒定目的蛋白大小。
　　4.2 懸浮培養(yǎng)初探
　　將T75中貼壁培養(yǎng)的高表達(dá)株進(jìn)行B001懸浮馴化，得到適合懸浮生

7、長(zhǎng)的穩(wěn)定高表達(dá)工程細(xì)胞株。
　　5. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白活性的測(cè)定通過MTT法測(cè)定sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT中和TNF-α殺傷L929細(xì)胞的活性，比較目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT、標(biāo)準(zhǔn)蛋白sTNFRⅡ-Fc以及實(shí)驗(yàn)室原先構(gòu)建的蛋白s

8、TNFRⅡ-gAD-Fc、sTNFRⅡ-gAD拮抗TNFα的能力的差異。
　　結(jié)果：
　　1. 成功得到sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因RT-PCR后用1.2％的瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果，成功得到與預(yù)期條帶大小一致的片段。
　　2. 成功構(gòu)建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-a

9、diponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-MT表達(dá)質(zhì)粒
　　提質(zhì)粒酶切后，用1.2％的瓊脂糖鑒定酶切結(jié)果，得到條帶與預(yù)期位置相符，將該質(zhì)粒送測(cè)序鑒定目的基因，與NCBI上獲取的基因序列比對(duì)后完全一致，提示成功構(gòu)建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adip

10、onectin-MT表達(dá)質(zhì)粒。
　　3. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白在CHO細(xì)胞中高表達(dá)
　　電轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)過單克隆化后用G418加壓篩選，通過Dot-Blot篩選高表達(dá)株，經(jīng)過2輪篩選后，挑選表達(dá)量高的細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，能得到高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
　　4. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合

11、蛋白的純化
　　鎳柱純化時(shí)，目的蛋白約在120mM左右濃度的咪唑洗脫下來，純化后成功得到目的蛋白。經(jīng)過WB鑒定，目的蛋白單體大小為70KD左右，并且以多聚體的形式存在。
　　5. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白活性的測(cè)定
　　sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白具有顯著抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞的

12、活性，且隨蛋白濃度的升高，抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞越明顯，即呈劑量依賴性。相對(duì)于標(biāo)品sTNFRⅡ-Fc來說，目的蛋白活性明顯較強(qiáng)，但活性還是低于之前實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的融合蛋白sTNFRⅡ-gAD。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了sTNFRⅡ-adiponectin-WT、sTNFRⅡ-adiponectin-MT真核表達(dá)載體，并在CHO細(xì)胞中得到蛋白表達(dá)，已篩選出高表達(dá)單克隆細(xì)胞株。收取細(xì)胞上清，經(jīng)過鎳柱純化獲得一定體積的蛋