PGAM1表達(dá)與睪丸生精功能的關(guān)系及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的：
　　1.探討PGAM1在人不同類型睪丸組織中的表達(dá)及其臨床意義。
　　2.探討PGAM1在生精功能不良動物模型中的表達(dá)及其意義。
　　3.探討PGAM1的生物學(xué)功能及相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.收集40例不同組織學(xué)類型的睪丸組織（生精功能正常10例，輕度生精功能不良10例，重度生精功能不良10例，唯支持細(xì)胞綜合征10例），經(jīng)固定、脫水制成石蠟組織塊，采用免疫組化檢測PGAM1在不同組織學(xué)類型

2、睪丸組織中的表達(dá)情況，并分析PGAM1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　2.收集8例不同組織學(xué)類型的新鮮睪丸組織標(biāo)本（生精功能正常2例，輕度生精功能不良2例，重度生精功能不良2例，唯支持細(xì)胞綜合征2例），經(jīng)組織研磨提取RNA，采用qRT-PCR定量檢測PGAMmRNA表達(dá)水平，并分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。
　　3.挑選10只6W大的C57雄性小鼠，體重約為19～21g，隨機(jī)分為實驗組及對照組。其中，實驗組采用白消安(30

3、 mg/kg)及二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行腹腔單次注射，構(gòu)建生精功能不良的C57動物模型，對照組僅注射等體積的DMSO。注射后2w，全部處死小鼠，收集小鼠睪丸組織。睪丸組織經(jīng)脫水、包埋做成石蠟組織。石蠟組織經(jīng)切片、脫水及脫蠟后行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察睪丸組織的形態(tài)學(xué)改變。同時，通過qRT-PCR及Western blot檢測實驗組及對照組睪丸組織中PGAM1的表達(dá)情況，分析睪丸生精功能與PGAM1表達(dá)的關(guān)系。
　　4.首先

4、通過qRT-PCR檢測PGAM1 mRNA在小鼠精原細(xì)胞株GC1、小鼠精母細(xì)胞株GC2及支持細(xì)胞株TM4中的表達(dá)水平，然后通過siRNA干擾技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染敲低GC1及TM4中PGAM1 mRNA的表達(dá)水平，并通過qRT-PCR及Westernblot進(jìn)行驗證。
　　5，通過MTT實驗分別檢測PGAM1表達(dá)下調(diào)對GC1及TM4細(xì)胞增殖能力的影響;通過流式細(xì)胞儀分別檢測PGAM1表達(dá)下調(diào)對GC1及TM4細(xì)胞凋亡的影響;通過劃痕實驗分別檢

5、測PGAM1表達(dá)下調(diào)對GC1及TM4細(xì)胞運(yùn)動能力的影響。
　　6.采用免疫組化及Western blot檢測PGAM1表達(dá)下調(diào)后下游凋亡相關(guān)蛋白Caspase6及caspase9、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，初步探討PGAM1的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化檢測PGAM1在不同組織學(xué)類型睪丸組織中的表達(dá)
　　免疫組化檢測結(jié)果表明PGAM1陽性表達(dá)于生精功能正常的睪丸組織，主要定位于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞

6、及支持細(xì)胞的胞核及胞質(zhì)中，而精子細(xì)胞中無明顯陽性表達(dá)。其中，在40例不同類型睪丸組織中，PGAM1在生精功能正常、輕度生精功能不良、重度生精功能不良及唯支持細(xì)胞綜合征中的高表達(dá)率分別為90％(9/10)，80％(8/10)，10％(1/10)，100％(10/10)，組內(nèi)比較，差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。然而，其表達(dá)與患者的年齡、睪丸體積、FSH、LH及T水平均無明顯相關(guān)(P＞0.05)。
　　2.qRT-PCR檢測

7、PGAM1在不同類型睪丸組織中的表達(dá)
　　為進(jìn)一步探討PGAM1表達(dá)與睪丸生精功能的關(guān)系，我們通過qRT-PCR定量檢測了PGAM1在生精功能正常、輕度生精功能不良、重度生精功能不良及唯支持細(xì)胞綜合征睪丸組織中的表達(dá)水平，結(jié)果提示PGAM1 mRNA水平在生精功能正常睪丸組織中的表達(dá)明顯高于重度生精不良，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。結(jié)果也顯示PGAM1mRNA水平與患者的年齡、睪丸體積、FSH、LH及T水平均無明顯相關(guān)(

8、P＞0.05)。
　　3.PGAM1在生精功能不良動物模型中的表達(dá)
　　為驗證白消安單次腹腔注射后，是否能影響睪丸的生精功能，我們通過HE染色觀察了實驗組與對照組睪丸的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果所示，對照組睪丸組織中的生精小管結(jié)構(gòu)清晰，生精小管內(nèi)生精細(xì)胞的排列及層次整齊，可見到大量成熟的精子集中于生精小管的中間管腔，提示DMSO注射并沒有影響睪丸的生精功能;與對照組相比，我們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)白消安注射后的實驗組小鼠睪丸組織中，生精小管發(fā)生明顯

9、的變形，并出現(xiàn)萎縮，生精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列紊亂，各級生精細(xì)胞（精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子）均明顯減少，提示經(jīng)白消安注射后睪丸組織出現(xiàn)了明顯的生精功能不良，睪丸生精功能不良的小鼠動物模型構(gòu)建成功。
　　隨后，我們通過免疫組化檢測了PGAM1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PGAM1在生精功能正常的睪丸組織中陽性表達(dá)于生精小管中的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及支持細(xì)胞的胞核及胞漿，同時也陽性表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞的胞核及胞漿。然而，PGAM1在生

10、精功能低下的睪丸生精小管中的表達(dá)明顯減弱。qRT-PCR定量檢測結(jié)果顯示PGAM1在生精功能不良的睪丸組織中的表達(dá)明顯低于對照組生精功能正常的睪丸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時，Western blot定量檢測結(jié)果也顯示PGAM1在生精功能不良的睪丸組織中的表達(dá)明顯低于對照組生精功能正常的睪丸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.PGAM1表達(dá)下調(diào)對GC1及TM4生物學(xué)功能的影響
　　首先，我們

11、通過qRT-PCR定量檢測了PGAM1在小鼠精原細(xì)胞株(GC1)、小鼠精母細(xì)胞株(GC2)及小鼠支持細(xì)胞(TM4)中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PGAM1在GC1及TM4細(xì)胞株中的表達(dá)高于GC2。細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示PGAM1在GC1、GC2、TM4細(xì)胞株中表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其中PGAM1在GC1及TM4細(xì)胞中的陽性表達(dá)強(qiáng)于GC2。同時，免疫熒光結(jié)果也表明PGAM1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，PGAM1在GC1及TM4細(xì)胞中的陽性表達(dá)強(qiáng)于GC2細(xì)胞。

12、
　　隨后，為了進(jìn)一步明確PGAM1的生物學(xué)功能，我們采用siRNA干擾技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染敲低PGAM1mRNA在GC1及TM4細(xì)胞株中的表達(dá)水平，依據(jù)qRT-PCR實驗篩選出干擾效果最佳的干擾片段進(jìn)行后續(xù)實驗，并采用Western blot進(jìn)行驗證。結(jié)果表明:針對PGAM1表達(dá)設(shè)計的三條干擾片段在GC1細(xì)胞中，下調(diào)PGAM1 mRNA的水平分別為24.7％、78.0％、32.0％。其中，與對照組相比，干擾片段2的干擾效果最佳，差異明顯

13、，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。在TM4細(xì)胞中，三條干擾片段下調(diào)PGAM1mRNA的水平分別為11.0％、84.0％、31.3％。與對照組相比，干擾片段2的干擾效果也是最佳，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。為此，我們選擇干擾片段2進(jìn)行后續(xù)的研究。隨后，我們采用Western blot分別檢測了干擾片段2在GC1及TM4細(xì)胞中對PGAM1的干擾效果，結(jié)果顯示經(jīng)干擾片段2轉(zhuǎn)染后，PGAM1表達(dá)明顯下調(diào)。
　　為探討PG

14、AM1表達(dá)下調(diào)對GC1及TM4細(xì)胞增殖能力的影響，我們進(jìn)行了MTT實驗。結(jié)果表明在GC1細(xì)胞中，PGAM1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞的生長曲線較平緩，OD值明顯較低，提示PGAM1表達(dá)下調(diào)后GC1細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(P=0.000)。同時，在TM4細(xì)胞中，PGAM1表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞的生長曲線與對照組相比，也較平緩，OD值明顯低于對照組，提示PGAM1表達(dá)下調(diào)后TM4細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(P=0.000)。
　　為探討PGAM1表達(dá)下調(diào)對

15、GC1及TM4細(xì)胞凋亡能力的影響，我們采用流式細(xì)胞儀檢測了細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示:對照組GC1細(xì)胞的凋亡為2.1％±0.5％，而PGAM1表達(dá)下調(diào)后GC1細(xì)胞的凋亡率為11.8％±1.5％，明顯高于對照組，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。同時，對照組TM4細(xì)胞的凋亡為8.7％±2.4％，而PGAM1表達(dá)下調(diào)后GC1細(xì)胞的凋亡率為18.1％±3.9％，明顯高于對照組，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。
　　為探

16、討PGAM1表達(dá)下調(diào)對GC1及TM4細(xì)胞運(yùn)動能力的影響，我們進(jìn)行了劃痕實驗。結(jié)果表明PGAM1表達(dá)下調(diào)后24h，TM4細(xì)胞的遷移距離明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，提示PGAM1表達(dá)下調(diào)明顯抑制了TM4細(xì)胞的遷移。然而，PGAM1表達(dá)下調(diào)后24h，GC1細(xì)胞的遷移距離無明顯變化，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.786)，提示PGAM1表達(dá)下調(diào)明對GC1細(xì)胞的遷移能力無明顯影響。
　　5.PGAM1表達(dá)下調(diào)對下游

17、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　為探討PGAM1發(fā)揮生物學(xué)功能的潛在機(jī)制，我們通過Western blot檢測了PGAM1表達(dá)下調(diào)后，凋亡相關(guān)蛋白Caspase6及Caspase9的表達(dá)情況，同時也檢測了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果表明，PGAM1表達(dá)下調(diào)后Caspase6及Caspase9表達(dá)均出現(xiàn)明顯上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示PGAM1的表達(dá)下調(diào)激活了Caspases及Bcl-2信號通路。
　　結(jié)論：<