人HT、DAF和CD59基因聯(lián)合轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及其抗異種器官移植免疫排斥反應(yīng)的研究.pdf

1、目前認(rèn)為從多個環(huán)節(jié)干預(yù)異種移植排斥反應(yīng)才有可能使動物器官應(yīng)用于臨床。本實驗采用受精卵顯微注射技術(shù)將本室構(gòu)建的人α1,2-巖藻糖苷轉(zhuǎn)移酶(HT)基因、人衰變加速因子(DAF)和人膜反應(yīng)性溶解抑制物(CD59)基因構(gòu)件導(dǎo)入到小鼠的受精卵的雄原核中，通過受精卵移植建立表達(dá)多基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察這些基因轉(zhuǎn)移小鼠抗異種移植超急性排斥反應(yīng)(HAR)的效果，并對其抗急性血管排斥反應(yīng)(AVR)的機(jī)制進(jìn)行初步研究。 第一部分人衰變加速因子重組質(zhì)

2、粒的構(gòu)建 目的:構(gòu)建含雜合增強(qiáng)子UI的人DAF重組基因，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物克服異種器官移植排斥反應(yīng)的研究。 方法:ClaI/EcoRI雙酶切質(zhì)粒pSP73得到UI增強(qiáng)子插入片段(0.3Kb)，將其插入pBluescriptⅡSK+克隆載體的相應(yīng)酶切位點之間；XbaI/BamHI雙酶切質(zhì)粒pGEM-7zf-DAF，得到含人ICAM-2啟動子及DAFcDNA序列的插入片段(3.7Kb)，將其也插入到pBluescriptⅡSK

3、+克隆載體的相應(yīng)酶切位點之間。隨后轉(zhuǎn)化細(xì)菌，陽性轉(zhuǎn)化菌落質(zhì)粒抽提及酶切鑒定。設(shè)計引物行PCR特異擴(kuò)增檢驗。 結(jié)果:特異性3組酶切重組載體均產(chǎn)生了符合要求的相應(yīng)條帶；PCR擴(kuò)增出特異的330bp及321bp的片斷，符合設(shè)計要求。 結(jié)論:含雜合增強(qiáng)子UI的人DAF重組基因構(gòu)建成功。 第二部分人HT/CD59及DAF基因轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)基因鼠的制備 目的:制備轉(zhuǎn)移人HT/CD59雙基因和人DAF單基因的首代轉(zhuǎn)基因小鼠。

4、 方法:限制性內(nèi)切酶NotI/PvuI雙酶切人HT基因重組質(zhì)粒得到2.85kb的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件；限制性內(nèi)切酶XbaI/ClaI雙酶切人DAF基因重組質(zhì)粒得到4.0kb的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件；限制性內(nèi)切酶BalⅡ/SmaI雙酶切人CD59基因重組質(zhì)粒得到2.5kb的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件。采用受精卵顯微注射技術(shù)將人HT與CD59轉(zhuǎn)基因構(gòu)件同時導(dǎo)入小鼠受精卵雄原核，將人DAF轉(zhuǎn)基因構(gòu)件單獨導(dǎo)入小鼠受精卵雄原核制備轉(zhuǎn)基因小鼠。 結(jié)果:將人HT/CD59

5、轉(zhuǎn)基因構(gòu)件同時導(dǎo)入2104枚受精卵，出生首代小鼠132只；將人DAF轉(zhuǎn)基因構(gòu)件導(dǎo)入1123枚受精卵，出生首代小鼠89只。 結(jié)論:成功制備了轉(zhuǎn)移人HT/CD59雙基因和人DAF單基因的首代轉(zhuǎn)基因小鼠。 第三部分轉(zhuǎn)基因鼠人HT/CD59及DAF基因的整合與表達(dá) 目的:篩選出表達(dá)人HT/CD59、DAF基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。 方法:常規(guī)提取首代小鼠基因組DNA，設(shè)計特異引物用PCR方法對外源基因整合進(jìn)行初步篩選。對

6、PCR反應(yīng)出現(xiàn)特異條帶的小鼠基因組DNA進(jìn)行Southern印跡雜交進(jìn)一步證實外源基因的整合。抽取外源基因整合陽性小鼠外周血，用流式細(xì)胞計數(shù)(FCM)方法檢測外源基因的表達(dá)。提取外源基因表達(dá)陽性小鼠心臟、肝臟、腎臟和肺臟等主要器官的總RNA行RT-PCR反應(yīng)，觀察外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)主要器官的表達(dá)情況。對人HT基因表達(dá)陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠主要器官進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察其表達(dá)對α-Gal抗原表達(dá)的影響。 結(jié)果:經(jīng)PCR篩選，出

7、現(xiàn)330bp、915bp、224bp特異條帶的小鼠分別有42只、32只、41只，其中8只同時出現(xiàn)了915bp和224bp的特異條帶。Southern印跡雜交結(jié)果證實染色體中整合人HT、DAF、CD59基因的小鼠分別有15只、20只、19只，其中5只同時整合人HT和CD59基因。FCM檢測發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞(PBMCs)表達(dá)人H抗原、DAF、CD59的小鼠分別有10只、4只、8只，其中4只小鼠人H抗原和CD59同時表達(dá)。FCM檢測陽性的轉(zhuǎn)

8、人HT、DAF和CD59基因小鼠相應(yīng)的心臟、肝臟、腎臟和肺臟mRNA均表達(dá)陽性，并且各個器官組織之間的表達(dá)水平差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。人HT基因表達(dá)陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)心臟、腎臟、肝臟和肺臟等不同組織H抗原均表達(dá)陽性，同時相應(yīng)組織的α-Gal抗原表達(dá)顯著下降。 結(jié)論:本實驗制備的首代小鼠中有人HT、CD59和DAF分別表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠以及人HT與CD59基因同時表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，并且人HT基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)α-G

9、al抗原表達(dá)降低。 第四部分轉(zhuǎn)基因鼠的傳代及三基因共表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠的建立 目的:探討外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的遺傳與表達(dá)規(guī)律并獲得三基因共表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠。 方法:G0代人HT/CD59基因同時表達(dá)陽性的轉(zhuǎn)基因鼠與G0代人DAF基因表達(dá)陽性的轉(zhuǎn)基因鼠交配生產(chǎn)F1代，同樣方法生產(chǎn)F2代小鼠。外源基因的整合與表達(dá)檢測方法同前。 結(jié)果:出生F1代小鼠17只，人DAF、HT、CD59基因整合的小鼠分別為9只、9只、1

10、0只，表達(dá)的分別為8只、7只、8只；人HT/DAF、HT/CD59、HT/CD59/DAF基因共整合的分別為2只、3只、2只，其中共表達(dá)的分別為2只、2只、1只。出生F2代小鼠8只，人HT/DAF、HT/CD59、HT/CD59/DAF基因共整合的分別為3只、3只、0只，其中共表達(dá)的分別為2只、3只、0只。 結(jié)論:成功獲得三基因共表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，外源基因在子代小鼠體內(nèi)也可以表達(dá)，但表達(dá)水平不同。 第五部分轉(zhuǎn)基因鼠抗異種

11、器官移植排斥反應(yīng)的研究 目的:觀察轉(zhuǎn)基因克服異種器官移植超急性排斥反應(yīng)的能力，并初步探討其抑制急性血管排斥反應(yīng)的機(jī)制。 方法:將轉(zhuǎn)基因小鼠分為五組，第一組：普通小鼠；第二組：轉(zhuǎn)人HT基因；第三組：轉(zhuǎn)人HT/CD59雙基因；第四組：轉(zhuǎn)人HT/DAF雙基因；第五組：轉(zhuǎn)人HT/CD59/DAF三基因。采用改進(jìn)的Langendorff心臟灌流裝置用12％人AB血清灌注小鼠的離體心臟，觀察各組心臟的存活時間和不同時間的做功情況。采

12、用免疫組織化學(xué)觀察灌注心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞表面人IgM、IgG、C3c和C9的沉積、NF-κB的激活與ICAM-1和E-Selectin的表達(dá)。 結(jié)果:人AB血清灌注后，第一組小鼠心臟做功能力急劇下降，15min時僅為最大值20％，接近45min時心臟停止搏動。第二組小鼠心臟做功能力也下降，但在60min時心臟做功仍維持在最大值的27％以上，平均存活時間為118min，心臟做功能力與搏動時間均高于第一組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0

13、5)。第三組、第四組小鼠心臟做功能力與存活時間均顯著高于第一組和第二組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。第五組小鼠心臟做功能力與存活時間與第三組和第四組相似。觀察灌注心臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：第一組小鼠可見IgM、IgG、C3c和C9大量沉積，未見NF-κB、E-Selectin和ICAM-1陽性染色；第二組小鼠可見IgG沉積，C3c和C9沉積減少，未見IgM沉積，NF-κB、E-Select

14、in和ICAM-1陽性染色；第三組小鼠可見IgG和C3c沉積，未見IgM和C9沉積，第四組小鼠可見IgG沉積，C3c和C9少量沉積，未見IgM沉積，第五組小鼠可見IgG沉積，未見IgM、C3c、C9沉積。第三組、第四組和第五組小鼠均未見NF-κB、E-Selectin和ICAM-1陽性染色。 結(jié)論:轉(zhuǎn)人HT基因獲得了一定程度的抗異種移植HAR的能力；聯(lián)合轉(zhuǎn)基因可以克服異種移植HAR，并且可能通過抑制NF-κB激活而具有部分抑制A