供體脾細胞聯(lián)合抗CD154輸注誘導小鼠肺移植慢性排斥反應免疫耐受基因表達譜研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：小鼠氣道異位移植后肺移植慢性排斥反應模型的建立
　　 背景和目的：通過建立小鼠的氣道異位移植模型來模擬肺移植慢性排斥反應，為閉塞性細支氣管炎研究提供一種新的模型選擇。
　　 方法：同種異體移植組(Allograft組)以BALB/c小鼠為供者，C57BL/6小鼠為受者，同系移植組(Isograft組)供受者均為BALB/c小鼠。取供體小鼠的氣管、左右主支氣管連續(xù)氣道作為供體，異

2、位移植到受體小鼠背部皮下。分別于移植后第5、15、25天時，各取3只，將移植氣管段取出作病理組織學分析。
　　 結(jié)果：18例模型動物全部存活，無感染。病理切片示Allograft組小鼠移植氣管管腔閉塞，慢性炎細胞浸潤廣泛，氣管上皮完全脫落，纖維組織增生明顯，呈現(xiàn)閉塞性細支氣管炎表現(xiàn)；Isograft組小鼠移植氣管的組織形態(tài)未見明顯異常。
　　 結(jié)論：小鼠異位氣管移植的動物模型簡單、經(jīng)濟、穩(wěn)定性強、重復性好，能準確復制肺移

3、植后閉塞性細支氣管炎的病理過程。
　　 第二部分：小鼠肺移植慢性排斥反應模型移植氣道中基因差異表達譜研究
　　 背景和目的:閉塞性細支氣管炎（OB）是限制肺移植患者長期生存的主要因素，但無法被現(xiàn)有免疫抑制劑方案所逆轉(zhuǎn)。其發(fā)病機制尚不清楚。應用基因芯片技術分析肺移植后OB形成前期移植氣道的基因表達譜，為預防性干預提供理論依據(jù)。
　　 方法:首先建立小鼠異位氣道移植OB模型，BALB/c小鼠氣道異位移植到C57BL/

4、6小鼠（同種異體移植組）或BALB/c小鼠（同系移植組）背部皮下。分別在術后5、15和25d 取出移植氣道檢測形態(tài)學改變，并利用CSME-80 鼠cDNA 芯片檢測15d 兩組移植物內(nèi)基因表達差異，分析具有統(tǒng)計學意義的基因表達和OB發(fā)病的關系。選擇部分顯著差異表達基因行實時熒光定量或半定量RT-PCR 鑒定。
　　 結(jié)果:OB 前期存在大量基因表達變化，在兩個通道均有效的雜交信號中，上調(diào)表達的有422個，OB發(fā)生主要涉與UPP、

5、TGFβ等與細胞周期、細胞生存相關的基因類型。
　　 結(jié)論:肺移植后OB 前期是多因素參與的不平衡過程。大量基因與細胞生存相關，免疫性因素相對較少，提示可能的肺移植OB 治療策略的轉(zhuǎn)變，我們推測：肺移植BOS的治療策略應該由加強免疫抑制和抗炎治療為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐种萍±w維母細胞分化和組織重構為主，其中的主要效應細胞不再是淋巴細胞或巨噬細胞，而應是肌纖維母細胞。
　　 第三部分：供體脾細胞聯(lián)合抗CD154輸注誘導肺移植慢性排斥反

6、應免疫耐受的基因表達譜研究
　　 背景和目的:誘導特異性免疫耐受是解決臨床實體器官移植排斥反應等問題的理想措施，但其確切機制并不明確。我們應用基因芯片技術分析比較DST/anti-CD154方案誘導肺移植后閉塞性細支氣管炎免疫耐受和慢性排斥反應形成前期移植氣道的基因表達譜，進一步探討誘導免疫耐受的分子機制。
　　 方法:首先建立小鼠異位氣道移植OB 耐受模型：C57BL/6小鼠接受異位氣道移植前7天，取BALB/c小鼠脾

7、臟制備脾細胞懸液，將濃度0.5ml 2×107 脾細胞懸液經(jīng)尾靜脈緩慢注入。C57BL/6小鼠行抗小鼠CD154 腹腔注射：劑量0.5 mg/鼠，時間：分別于移植-7,-4,0,4天分次注入。對照組：同種異體移植組（BALB/c→C57BL/6）。術后15d，25d，100d 取出移植氣道檢測形態(tài)學改變，并利用CSME-80 鼠cDNA 芯片檢測15d時兩組移植物內(nèi)基因表達差異，分析具有統(tǒng)計學意義的基因表達與排斥和耐受之間的關系。選擇部

8、分顯著差異表達基因行實時熒光定量RT-PCR 鑒定。
　　 結(jié)果:DST/anti-CD154方案免疫耐受組OB前期存在顯著性表達差異（上下2倍變化）的基因有930個，其中與A組混合樣品相比在T組混合樣品中上調(diào)表達的基因有470個，下調(diào)表達的基因有460個。在兩個通道均為有效的雜交信號中，主要涉及到與細胞生存相關的各類基因，如細胞生長增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白合成及分解等相關基因，以及免疫相關基因。通過生物信息挖掘得到Rap1信號通路

9、、與CD40/CD40L相關及其它T細胞表面分子相關基因、與細胞周期、細胞生長等促進纖維增殖的部分基因明顯下調(diào)表達。部分促炎因子同同種異體移植組一樣上調(diào)表達。
　　 結(jié)論:Rap1信號通路、與CD40/CD40L 相關及其它T細胞表面分子相關基因、與細胞周期、細胞生長等促進纖維增殖下調(diào)表達的部分基因等可能與肺移植慢性排斥反應耐受密切相關。進一步闡明，肺移植OB形成過程中促纖維增殖相關基因的核心作用以及肺移植OB的治療策略轉(zhuǎn)變中抑