皮蠅素轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及其抑制皮膚移植排斥的研究.pdf

1、器官移植作為治療終末期器官衰竭患者的一種較有效的方法，在臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用，這也使人類器官供體相對缺乏的狀況越來嚴重，激起人們對異種移植的強烈興趣。然而，異種移植后將出現(xiàn)比同種異體移植更復雜的排斥反應(yīng)。如何解決是保證異種器官移植成功關(guān)鍵因素。移植器官“寄生蟲化”，及移植器官表達寄生蟲某些分泌蛋白，使移植物能模擬寄生蟲產(chǎn)生“免疫逃避”，從而長時間在受體內(nèi)成活，這一策略為解決異種器官移植排斥反應(yīng)提供了新思路。皮蠅素是一種可降解補體

2、的絲氨酸蛋白酶，它們在寄生蟲和宿主相互關(guān)系之間起著重要作用。幫助寄生蟲應(yīng)對宿主組織的侵襲，幫助逃避宿主的免疫系統(tǒng)。
　　本研究通過轉(zhuǎn)基因動物方式，使移植器官分泌皮蠅素A、C蛋白酶，建立移植器官“寄生蟲化”動物模型，應(yīng)用此模型進一步研究皮蠅素與補體系統(tǒng)作用機制。移植器官分泌皮蠅素抑制受體補體激活，調(diào)節(jié)各種異種移植排斥反應(yīng)，延長移植物存活時間，為解決異種器官移植排斥反應(yīng)提供新途徑。
　　1.皮蠅素分泌型真核表達載體的構(gòu)建

3、　　構(gòu)建分泌型真核表達載體pEF1-CD-HA-AcGFP和pEF1-CD-HC-AcGFP，該載體以EF1為啟動子，牛皮蠅一期幼蟲RT-PCR擴增出HA、HC基因cDNA為目的基因，序列上游融合IgK-chain secretion signal信號肽序列。將融合基因序列插入PEF1 a-IRES-AcGFP多克隆位點，應(yīng)用核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，構(gòu)建pEF1-CD-HA-AcGFP和pEF1-CD-HC-AcGFP重

4、組分泌型真核表達載體。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測序，正向反向測序結(jié)果與預(yù)期符合，用于下一步體外轉(zhuǎn)染實驗和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灐?br>　　2.皮蠅素A抗體的制備及鑒定
　　皮蠅素A（Hypodermin A HA）具有很好的免疫原性，以其作為免疫抗原，可以使被免疫的動物產(chǎn)生對牛皮蠅幼蟲的感染具有保護性的抗體。利用生物信息學對HA的抗原性及其親水性進行分析，提示該氨基酸具有較好的抗原性。并發(fā)現(xiàn)抗原表位主要分布在氨基酸的C端101-116，161-173

5、，37-50的三個區(qū)域。通過RP-HPLC方法測定人工合成的多肽發(fā)現(xiàn)其純度達到91.2％，并通過質(zhì)譜鑒定分子量與預(yù)計的分子量吻合為28 kD。然后與KLH連接，免疫新西蘭大白兔，得到了HA的多肽抗體。采用ELISA和western blotting方法驗證了抗體的特異性。ELISA結(jié)果顯示制備的HA多肽抗體特異性識別多肽，且滴度較高。并同時從牛皮蠅一期幼蟲中提取蛋白，對制備抗體、陰性血清和陽性血清進行westernblotting檢測，

6、結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備抗體和陽性血清分別在28KD處有目的條帶，而陰性血清沒有目的條帶。制備得到的HA多克隆抗體。為進一步研究HA的分子功能，提供了有用的工具。
　　3.皮蠅素轉(zhuǎn)基因表達載體體外轉(zhuǎn)染實驗
　　pEF1--CD-HA-AcGFP和pEF1--CD-HC-AcGFP體外轉(zhuǎn)染及抗補體損傷研究，應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Cos7細胞，RT-PCR與western blot檢測HA、HC是否成功表達;并用G418篩選得到了HA和HC的穩(wěn)定

7、表達細胞株。免疫共沉淀實驗檢測HA與C3是否相互作用。HA穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞分別與10％、40％的豚鼠血清37℃孵育100min，western blot與ELISA方法結(jié)果顯示，占比為10％的豚鼠血清與HA穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞孵育后，HA組較陰性對照達到了極顯著水平。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)HA與C3相互作用。通過EMSA實驗發(fā)現(xiàn)，HA通過主鏈底物結(jié)合位點(S225，T226，G227)與C3相互作用。同樣將HC穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞分別與10％、30％、50％的豚鼠血清37

8、℃孵育100min，western blot與ELISA方法結(jié)果顯示，占比為10％及30％的豚鼠血清組中，HC組較陰性對照達到了顯著水平。EMSA實驗發(fā)現(xiàn)，HC通過結(jié)合位點(S229，G230，A231)與C3相互作用。
　　4.皮蠅素轉(zhuǎn)基因模型鼠的制備
　　顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，ApalⅠ、StuⅠ內(nèi)切酶雙酶切pEF1-CD-HA-AcGFP、pEF1--CD-HC-AcGFP，回收序列為基因構(gòu)件，顯微注射入FVB小鼠

9、和C57BL/6J小鼠受精卵雄性原核內(nèi)，移植至假孕母鼠輸卵管，小鼠出生后剪尾提DNA，分別設(shè)計引物PCR檢測目的基因HA、HC。結(jié)果顯示，HA獲得4只陽性首建鼠，HC獲得9只首建鼠，陽性鼠分別與正常FVB小鼠和C57BL/6J小鼠雜交擴群。
　　5.模型鼠器官異種移植、抑制移植排斥反應(yīng)研究
　　皮膚通常是高度敏感的，皮膚移植通常被認為是會引起非常強的排斥反應(yīng)，本研究中，將HA轉(zhuǎn)基因小鼠來進行小鼠皮膚移植實驗，來研究HA的免疫

10、抑制作用及對補體成分的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HA轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚移植存活的時間與對照組相比明顯延長，表明在體內(nèi)HA也具有較好的免疫抑制作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)HA通過裂解補體C3，延長補體活化，從而降低同種異體移植物的排斥，降低潛在的有害影響。本研究結(jié)果中清楚地表明，在HA轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚移植中C3，C9，CD4和B7-2等含量與對照組相比顯著降低。延長了HA轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚移植物的存活。在一些炎癥過程中，補體成分也是一個關(guān)鍵的因素。根據(jù)本研究中

11、移植皮膚炎癥期的記錄和HE染色結(jié)果表明，皮膚移植后炎癥期峰值是出現(xiàn)在1-4d之間，各組間的炎性細胞浸潤有比較顯著的差異。
　　綜上所述，HA與HC均具有免疫抑制的特性，HA與HC在體外均可以抑制補體的活性，降低細胞介導的抑制。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，HA在轉(zhuǎn)基因皮膚移植小鼠模型的實驗中體現(xiàn)了比較重要的作用。與對照組相比，HA轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚移植存活時間明顯延長，表明HA在應(yīng)用于提高移植物的存活時間上可能是個不錯的選擇。今后我們將進一步深