腎母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩選及鑒定.pdf

1、研究背景:腎母細(xì)胞瘤或稱腎胚胎瘤,又稱Wilm’s瘤(WT),是小兒最常見(jiàn)的惡性實(shí)質(zhì)性腫瘤之一。目前認(rèn)為分期及分型是影響預(yù)后的重要因素,與腫瘤大小無(wú)關(guān)。早期診斷對(duì)腎母細(xì)胞瘤的治療以及患兒的預(yù)后具有重大意義。
　　現(xiàn)階段臨床上診斷腎母細(xì)胞瘤主要依靠臨床癥狀結(jié)合超聲、IVU、CT等檢查,多數(shù)病例雖術(shù)前可確診,但是因未能及早發(fā)現(xiàn)就診而誤失治療時(shí)機(jī)影響預(yù)后。因此,尋找一種可行的能夠早期診斷腎母細(xì)胞瘤的方法對(duì)其治療和預(yù)后是十分重要的。隨著蛋

2、白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,理想的血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物作為早期篩查和診斷指標(biāo)值得關(guān)注和研究。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可高通量快速的篩檢腫瘤不同發(fā)生階段基因表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,從而發(fā)現(xiàn)大量有診斷價(jià)值的蛋白質(zhì)標(biāo)志分子,而這些蛋白能夠?yàn)槟[瘤治療提供靶點(diǎn),為早期診斷提供有效腫瘤標(biāo)志。2002年誕生的表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-massspectr

3、um,SELDI-TOF-MS)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)已廣泛用于各類疾病特異性生物標(biāo)志物的檢測(cè)和篩選,并取得了一系列突破性進(jìn)展。SELDI-TOF-MS技術(shù)作為一項(xiàng)新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,具有樣品用量小、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn),通過(guò)結(jié)合MALDI-TOF-MS、LC-MS/MS等技術(shù)已經(jīng)鑒定出了乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤血清中的相關(guān)特異性蛋白。迄今為止對(duì)小兒腎母細(xì)胞瘤的相關(guān)特異性蛋白的鑒定尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本研究應(yīng)用表面增

4、強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測(cè)腎母細(xì)胞瘤患兒手術(shù)前后及正常小兒血清蛋白質(zhì)組,篩選出特異的蛋白質(zhì)標(biāo)志物,并用質(zhì)譜鑒定技術(shù)對(duì)篩選出特異的蛋白質(zhì)標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。研究目的篩選腎母細(xì)胞瘤特異性血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物并對(duì)其進(jìn)行鑒定,以期確定其作為腎母細(xì)胞瘤血清學(xué)診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的特異標(biāo)志物。
　　材料與方法:1.臨床資料血清標(biāo)本130例均來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科,其中腎母細(xì)胞瘤術(shù)前標(biāo)本30例(Ⅰ期6例、Ⅱ期10

5、例、Ⅲ期10例、Ⅳ期4例),術(shù)后2周24例(行根治術(shù)21例、行姑息切除術(shù)3例),1例于術(shù)后兩月死亡,術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月各23例。正常對(duì)照組30例來(lái)自門診體檢的健康小兒,男21例,女9例,平均年齡(2.6±0.1)歲。30例腎母細(xì)胞瘤標(biāo)本均經(jīng)免疫組化和2位以上病理學(xué)教授證實(shí),其中男21例,女9例,年齡24 d~10歲,平均年齡(2.8±0.1)歲;進(jìn)行手術(shù)后配對(duì)研究的24例患兒中男16例,女8例,平均年齡(2.2±0.1)歲,術(shù)前均未接受

6、放化療。正常對(duì)照組與腎母細(xì)胞瘤組年齡性別相配對(duì)。外周靜脈血標(biāo)本均于清晨空腹時(shí)抽取,室溫下靜置1 h后3000 r/min離心10min,收集血清樣本,儲(chǔ)存于-80℃保存?zhèn)溆谩?.主要試劑和儀器3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS),尿素,二硫蘇糖醇(DTT),NaAC,芥子酸(SPA),胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Ciphergen PBSⅡ+ SELDI-TOF-MS和WCX2蛋白質(zhì)芯片購(gòu)自美國(guó)Ciphe

7、rgen公司。乙腈、a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、胰島素、細(xì)胞色素C、碘乙酰胺(IAM)、NH4HCO3均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。SHIMADZU LC-10Avp高效液相色譜(HPLC)儀購(gòu)自日本島津公司?；|(zhì)輔助激光解吸附電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜(AXIMA-CFRTM plus MALDI-TOF-MS)購(gòu)自英國(guó)Kratos Analytical公司。離心濃縮儀、液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)均購(gòu)自美國(guó)Thermo elec

8、tron公司。3.實(shí)驗(yàn)方法:3.1、 SELDI蛋白質(zhì)芯片操作:血清標(biāo)本冰浴解凍,4℃離心;取96孔板置冰盒上,每孔加U9(9MUrea,2％CHAPS,1％DTT)10ul,血清5ul,4℃層析柜600r/min振蕩30min。震蕩結(jié)束前15min做芯片預(yù)處理,芯片裝入Bioprocessor中,記錄芯片號(hào);每孔加醋酸鈉(100mmol/L PH4)200ul,層析;U9處理后的96孔板置冰上,排槍加醋酸鈉185 ul,層析;取已處理

9、的樣本100ul加入到芯片上,層析,甩去殘液,快速拍干。加醋酸鈉200 ul,振蕩,甩掉,拍干。200 ul去離子水200 ul沖洗、甩干。芯片風(fēng)干后,每孔分兩次加入50％飽和SPA1 ul,干燥后上機(jī)待測(cè)。3.2、差異蛋白質(zhì)峰的純化:于-80℃冰箱中取出血清樣本,冰水浴中解凍。解凍后,取血清100μl,加入350μl超純水,再加入700μl純乙腈。將上述混合液置入-20℃冰箱中,30min后取出,離心10min(13000r/min)

10、,上清液移入新試管置入SPD SpeedVac中凍干約20min。將凍干后的樣品上樣至HPLC中。收集不同時(shí)間的純化液。將純化出的蛋白液置入SPD SpeedVac中凍干至約20μl。將上述樣品與CHCA各取1.5μl,兩者混合后點(diǎn)樣至MALDI靶板,待干。同時(shí)用細(xì)胞色素C(相對(duì)分子質(zhì)量12361.96)+CHCA和胰島素(相對(duì)分子質(zhì)量5734.51)+CHCA校樣。將靶板置入MALDI-TOF-MS中檢測(cè),找出SELDI-TOF-MS

11、所篩質(zhì)荷峰值的特異樣本。3.3、酶解、質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索:將特異蛋白質(zhì)樣品加超純水至容積40μl,再加入配好的濃度為0.1mol/L的DTT溶液4μl后,置于37℃溫水中水浴1h。向44μl的溶液中加入1.6μl的IAM后避光放置1h。再向45.6μl的溶液中依次加入1.6μl的1mol/L的DTT溶液、150μl的0.1mol/L的NH4HCO3溶液和2μl的胰蛋白酶,然后37℃溫水過(guò)夜。取經(jīng)酶解后的蛋白液上樣至毛細(xì)色譜柱后,采用L

12、C-MS/MS進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,分析得到的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)使用SEQUST檢索程序查詢Bioworks公司提供的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。4.數(shù)據(jù)收集與處理用已知分子量的蛋白芯片將SELDI-TOF-MS系統(tǒng)校正到分子量誤差<0.1％。將結(jié)合好蛋白質(zhì)的WCX2蛋白質(zhì)芯片用質(zhì)譜閱讀儀分析。分析參數(shù):激光強(qiáng)度為170,靈敏度為6,每個(gè)樣本收集總點(diǎn)數(shù)140次。收集數(shù)據(jù)范圍1000~30000,優(yōu)化范圍2000~20000。以質(zhì)控血清作重復(fù)性檢

13、測(cè),其峰值大小和強(qiáng)度變異系數(shù)為0.05％和19.7％。數(shù)據(jù)用Proteinchip Software3.1校正。ZUCI-Protein Chip Data Analyze System軟件包分析,離散小波分析去除噪音,減掉基線。用局部極值的方法找出樣本各自的峰,并過(guò)濾掉信噪比小于2的峰。以10％為最小閾值做聚類分析,將各個(gè)樣本中m/z的差異小于0.3％的峰聚為一類。支持向量機(jī)分類器設(shè)置:采用徑向基核函數(shù),Gamma值設(shè)為0.6,罰分函

14、數(shù)(C)設(shè)為19。特征向量的選擇采用統(tǒng)計(jì)過(guò)濾結(jié)合模型依賴性篩選方法,建立判別模型,用留一法交叉驗(yàn)證評(píng)估模型的判別效果。采用判別分析方法處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)經(jīng)S處理得到的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾噪音,聚類分析處理后,對(duì)初步篩選出的質(zhì)荷比峰數(shù)據(jù)做Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α=0.01。
　　結(jié)果:1.SELDI-TOF-MS檢測(cè):術(shù)前組和正常小兒組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)初步過(guò)濾篩選和統(tǒng)計(jì)分析后得到P值小于0.01的m

15、/z峰11個(gè),從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的youden指數(shù)(陽(yáng)性率與陰性率之差)最高的組合模型,篩出m/z位于6455.5和6984.4的蛋白質(zhì)標(biāo)志物2個(gè),在腎母細(xì)胞瘤組低表達(dá)(強(qiáng)度為1029.2±364.1、297.4±125.6),正常小兒組高表達(dá)(強(qiáng)度為2108.3±837.2,753.4±225.8),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)留一法交叉檢測(cè),在測(cè)試集上判別該兩個(gè)標(biāo)志物組合模型的特異性為10

16、0％,敏感度為100％。腎母細(xì)胞瘤手術(shù)前后組比較篩選到差異最顯著的m/z位于9190.8的蛋白質(zhì)標(biāo)志物,在術(shù)前組血清中低表達(dá)(強(qiáng)度為283.4±153.9),術(shù)后組中呈高表達(dá)(強(qiáng)度為5973.6±656.7),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);術(shù)后組和正常小兒組(表達(dá)強(qiáng)度為6231.0±519.4)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。2.差異蛋白質(zhì)峰的純化:將6455.5、9190.8高表達(dá)的正常小兒血清分離純化后共收集到25管不同組分

17、的蛋白質(zhì)液。經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè),發(fā)現(xiàn)兩管蛋白質(zhì)純化樣本分別是相對(duì)分子質(zhì)量6455.5和9190.8的特異蛋白質(zhì)。3.質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索:酶解上述兩管的蛋白質(zhì)樣品后,采用LC-MS/MS測(cè)定該蛋白質(zhì)的酶解肽段,將檢測(cè)得到的PMF經(jīng)過(guò)SEQUST檢索程序查詢Bioworks公司提供的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù),查得其對(duì)應(yīng)可能的蛋白質(zhì)為:6455.5為載脂蛋白CⅢ,所檢測(cè)到的肽段氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的人APO CⅢ序列匹配率為56.6％;