基于血清蛋白質(zhì)組學(xué)日本血吸蟲病診斷標(biāo)志物的篩選及其免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、目的：血吸蟲病仍然是主要寄生蟲疾病，全球約有2億人感染，7.79億人處于風(fēng)險之中，有效的疫苗和理想的診斷技術(shù)的缺乏可能是導(dǎo)致血吸蟲病難以控制的主要原因。本研究旨在利用血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選日本血吸蟲病診斷候選分子，并進(jìn)一步評估它們在血吸蟲病診斷和療效考核中的表現(xiàn)以及測試它們免疫宿主后的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　 方法：血吸蟲成蟲蛋白經(jīng)過兩維電泳（2-DE）后，再用血吸蟲感染血清進(jìn)行Western-blot分析，將Western-b

2、lot結(jié)果與同源的經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的2-DE凝膠比對，切取匹配的點(diǎn)用胰酶消化后進(jìn)行質(zhì)譜測序，分析質(zhì)譜測序結(jié)果，從中挑選潛在可能的生物標(biāo)志物進(jìn)一步克隆重組，原核表達(dá)出這些蛋白的編碼區(qū)全長產(chǎn)物。將純化后的原核表達(dá)產(chǎn)物包被于聚苯乙烯微量反應(yīng)板，用ELISA方法評估它們在血吸蟲病診斷中的價值；同時將這些純化抗原分別免疫BALB/c小鼠，定期收集小鼠血清，用ELISA方法檢測血清中的特異性IgG及其IgG1和IgG2a抗體，分離培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞，用

3、2μg/ml重組抗原刺激培養(yǎng)細(xì)胞，檢測培養(yǎng)上清中的INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10細(xì)胞因子，用Real-time PCR方法定量檢測刺激后脾細(xì)胞的INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10細(xì)胞因子及其T-bet和GATA-3轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：利用血清蛋白質(zhì)組學(xué)方法從日本血吸蟲成蟲中篩選出30多個具有免疫反應(yīng)性的蛋白點(diǎn)，其中有10陽性點(diǎn)能夠與同源的2-DE凝膠明確匹配，質(zhì)譜測序結(jié)果顯示，這10個點(diǎn)對

4、應(yīng)4種不同的蛋白質(zhì)，它們分別是亮氨酸氨基肽酶（SjLAP）、果糖二磷酸醛縮酶（SjFBPA）、26kDa谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（SjGST）和22.6kDa血吸蟲表膜主要蛋白（Sj22.6），進(jìn)一步成功表達(dá)出了重組的SjLAP（rSjLAP）和SjFBPA（rSjFBPA），純化后的rSjLAP和rSjFBPA的蛋白濃度分別高達(dá)5mg/ml和4mg/ml；診斷評估中的ELISA結(jié)果顯示，rSjLAP對急性和慢性血吸蟲病的敏感性分別達(dá)到了98.1

5、％和87.8％，rSjFBPA對急性和慢性血吸蟲病的敏感性也分別達(dá)到了100％和84.7％，而兩個重組抗原的診斷特異性都達(dá)到了96.7％，在治療后不到6個月時，急慢性血吸蟲病患者血清中的兩種重組抗原的抗體滴度都發(fā)生有意義的下降（P<0.001），在6-12個月時，有80％患者血清中抗體恢復(fù)到正常人水平。rSjLAP和rSjFBPA抗原分別免疫BALB/c小鼠，2w后小鼠血清中的特異性IgG抗體迅速升高，至初次免疫后6w達(dá)到峰值，與特異性

6、IgG抗體結(jié)果一致的是，兩種抗原免疫后的小鼠血清中特異性IgG1也明顯升高，達(dá)6w后維持在較高水平，而血清中的特異性IgG2a在免疫后8w均沒有發(fā)生明顯變化。與對照組相比，刺激后的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA結(jié)果顯示，IL-4和IL-10細(xì)胞因子明顯升高，而INF-γ和IL-2沒有發(fā)生變化；Real-time PCR結(jié)果顯示，GATA-3、IL-4和IL-10表達(dá)水平也顯著升高，而T-bet、INF-γ和IL-2則不然。
　　 結(jié)論