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1、背景與目的: 腎母細(xì)胞瘤是兒童最常見的惡性腫瘤之一,全世界15歲以下兒童的發(fā)病率約為1/10,000。德國(guó)醫(yī)師Wilms于1899年首次報(bào)告此病,因此多數(shù)作者稱之為Wilms瘤。腎母細(xì)胞瘤是小兒最常見的由腎胚基發(fā)生的惡性腫瘤,2歲以下發(fā)病率最高。兒童惡性腫瘤的死亡率由20世紀(jì)80年代的8%上升到了10.7%,小兒腎母細(xì)胞瘤已經(jīng)成為小兒病死的主要原因之一。腎母細(xì)胞瘤的臨床病理分期和治療方法的選擇與患兒預(yù)后有直接的關(guān)系,NWTS在其
2、2001年的總結(jié)中提到:在目前的影像學(xué)技術(shù)條件下(依靠CT等)仍有7.0%的漏診率Ⅲ,主要是直徑小于3 c m的腎母細(xì)胞瘤。而表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization time of flight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)是近年發(fā)展起來的一種新的蛋白質(zhì)研究技術(shù),具有快速、簡(jiǎn)便、高通量及對(duì)多樣本平行檢驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn),質(zhì)譜
3、技術(shù)及生物信息學(xué)方法的出現(xiàn)提供了有效篩選特異性標(biāo)記物的方法。Ciphergen公司研發(fā)的SELDI-TOF-MS技術(shù)是一項(xiàng)全新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,該技術(shù)通過應(yīng)用少量天然蛋白質(zhì)提取物來進(jìn)行快速分析,克服了傳統(tǒng)分析方法的局限性。具有樣品用量小、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn),已成功將其應(yīng)用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、直腸癌等惡性腫瘤的診斷、腫瘤標(biāo)志物的篩選及其他蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。本組應(yīng)用該技術(shù)在肝癌,甲狀腺癌及腎母細(xì)胞瘤前期研究中
4、獲得滿意效果。應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)和支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)方法,篩選出腎母細(xì)胞瘤患兒特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物,建立腎母細(xì)胞瘤臨床分期血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型并與CT分期進(jìn)行對(duì)照分析。 材料與方法: (1)血清標(biāo)本共80例均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科,其中術(shù)前腎母細(xì)胞瘤30例,其它小兒腹惡性實(shí)體腫瘤30例(神經(jīng)母細(xì)胞瘤16例,肝母細(xì)胞瘤4例,腎橫紋肌肉瘤4
5、例,惡性畸胎瘤4例,胰母細(xì)胞瘤2例),正常對(duì)照組20例均來自體檢的健康小兒。 (2)樣本冰融,4℃10000 rpm離心2 min;取96孔板,放冰盒上,每孔加U9(9MUrea,2%CHAPS,1%DTT) 10μl,血清5μl,4℃層析柜600 rpm振蕩30 min;振蕩結(jié)束前15 min做芯片預(yù)處理,芯片裝入Bioprocessor中并記下芯片號(hào);每孔加NaAC(100Mm,pH4)200μl,層析柜中600 rpm,5
6、min,重復(fù)1次;U9處理后96孔板放冰上,快速加入NaAC185μl在層析柜中6000 rpm振蕩2 min;加已處理好的樣本100μl到芯片,層析柜4℃600 rpm振蕩1 h,甩干,重復(fù)3次;用hplc水200μl洗2次快速甩干;用50%飽和的SPA 1μl重復(fù)2次;上機(jī)檢測(cè);將芯片放入Ciphergen讀譜儀中檢測(cè)。 (3)用protein chip software 3.1做校正,使總離子的強(qiáng)度及分子量均一化。應(yīng)用ZU
7、CI-Protein Chip Data Analyze System軟件包進(jìn)行分析。原始數(shù)據(jù)用離散小波(undecimated discrete wavelet transform)分析去除噪音,并減掉基線。聚類分析以10%為最小閾值,將各個(gè)樣本中m/z的差異小于0.3%的峰聚為一類。支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)特征向量的選取采用統(tǒng)計(jì)過濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法建立判別模型,用留一法交叉驗(yàn)證作為評(píng)
8、估模型判別效果。 (4).統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的蛋白質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾掉信躁和聚類分析處理后,對(duì)所有初步篩選出的質(zhì)荷比峰做Wileonxon秩和檢驗(yàn),選出p值最小的10個(gè)峰進(jìn)一步分析。將10個(gè)峰的任意組合(共175種組合)用于支持向量機(jī)模型的輸入,用留一法評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效果,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)α=0.01 結(jié)果1.腎母細(xì)胞瘤Ⅰ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到483個(gè)M/Z峰,對(duì)其
9、相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰5個(gè),從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型,篩選出M/Z位于7965.4、5022.4和8469.6的標(biāo)志物3個(gè),在腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期低表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值,用留一法交叉檢驗(yàn),在測(cè)試集上判別模型的敏感性為100%,特異性為100%。 2.腎母細(xì)胞瘤Ⅰ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組
10、腎母細(xì)胞瘤Ⅰ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到496個(gè)M/Z峰,對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰4個(gè),從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型,篩選出M/Z位于4263.1、4122.8、4330.7和4303.7的標(biāo)志物4個(gè),在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組低表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值,用留一法交叉檢驗(yàn),在測(cè)試集
11、上判別模型的敏感性為100.00%,特異性為100.00%。 3.腎母細(xì)胞瘤Ⅰ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅰ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到565個(gè)M/Z峰,對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰4個(gè),從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型,篩選出M/Z位于10836.6和8179.1的標(biāo)志物2個(gè),在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期低
12、表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值,用留一法交叉檢驗(yàn),在測(cè)試集上判別模型的敏感性為88.89%,特異性為100.00%。 4.腎母細(xì)胞瘤Ⅱ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅱ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到490個(gè)M/Z峰,對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰3個(gè),從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組
13、合模型,篩選出M/Z位于5019.2和4143.2的標(biāo)志物2個(gè),在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組低表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值,用留一法交叉檢驗(yàn),在測(cè)試集上判別模型的敏感性為88.89%,特異性為100.00%。 5.腎母細(xì)胞瘤Ⅱ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅱ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到508個(gè)M/Z峰,對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰20個(gè),從
14、差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型,篩選出M/Z位于7976.5的標(biāo)志物1個(gè),在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組低表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值,用留一法交叉檢驗(yàn),在測(cè)試集上判別模型的敏感性為100.00%,特異性為100.00%。 6.腎母細(xì)胞瘤Ⅲ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅲ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到504個(gè)M/Z峰,對(duì)其相對(duì)強(qiáng)
15、度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰12個(gè),從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型,篩選出M/Z位于8194.4的標(biāo)志物1個(gè),在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組低表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值,用留一法交叉檢驗(yàn),在測(cè)試集上判別模型的敏感性為93.75%,特異性為100,00%。 7.腎母細(xì)胞瘤Ⅰ+Ⅱ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ+Ⅳ期組腎母
16、細(xì)胞瘤Ⅰ+Ⅱ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ+Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到519個(gè)M/Z峰,對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰3個(gè),從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型,篩選出M/Z位于4153.9,3257.6和3290.7的標(biāo)志物3個(gè),在腎母細(xì)胞瘤組Ⅲ+Ⅳ期低表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅰ+Ⅱ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值,用留一法交叉檢驗(yàn),在測(cè)試集
17、上判別模型的敏感性為83.33%,特異性為93.75%。 8.臨床各分期的對(duì)照:通過腎母細(xì)胞瘤早期診斷模型中的2個(gè)m/z(6984.4,6455.5)血清標(biāo)記物進(jìn)行分析得出腎母細(xì)胞瘤各期情況如下:Ⅳ期相對(duì)于Ⅲ期低表達(dá);Ⅲ期相對(duì)于Ⅱ期低表達(dá):Ⅱ期相對(duì)于Ⅰ期低表達(dá);Ⅰ期相對(duì)于正常兒童低表達(dá);后者相對(duì)高表達(dá);臨床分期越晚M/Z強(qiáng)度就越低表達(dá)。 9.盲法驗(yàn)證CT與蛋白質(zhì)芯片分期的準(zhǔn)確性:蛋白芯片分期如下:Ⅰ期6例,Ⅱ期10例,Ⅲ
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