腎母細(xì)胞瘤血清及瘤體組織剔除炎癥因子干擾后標(biāo)記物的篩選、鑒定及驗(yàn)證.pdf

1、研究背景與研究目的:
　　腎母細(xì)胞瘤是小兒泌尿系統(tǒng)最常見的惡性實(shí)體腫瘤。腎母細(xì)胞瘤是原發(fā)性腎臟惡性腫瘤，由于一些原始的腎胚胎細(xì)胞在發(fā)生的進(jìn)程中出現(xiàn)了基因調(diào)控的異常，進(jìn)而使細(xì)胞分化成熟出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致了細(xì)胞異常增殖分裂而不受控制。在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，經(jīng)?？梢钥吹皆嫉哪I小管和腎小球。大約75％的病例發(fā)生在5歲以內(nèi)的兒童，尤其多見于2～4歲的幼兒。腎母細(xì)胞瘤約93%為單側(cè)發(fā)病，大約10％的患兒為雙側(cè)發(fā)病，左右兩側(cè)的發(fā)病率大致相近，同時(shí)或

2、者相繼發(fā)生。發(fā)病率在男女性別上幾乎沒有差異，但是在大部分的病例報(bào)告中，男性患者發(fā)病率稍多于女性，也有極少病例發(fā)生于成人。腎母細(xì)胞瘤瘤體體積比較大，邊界分布清楚，部分腫瘤也可有假膜形成。腎母細(xì)胞瘤的切面顏色灰白，切面多呈爛魚肉樣，腫瘤質(zhì)地比較柔軟，大部分伴有出血和壞死等，也可見骨樣組織的出現(xiàn)。目前早期診斷、病理分型以及恰當(dāng)?shù)闹委煼绞绞怯绊懟純侯A(yù)后的主要因素。目前，腎母細(xì)胞瘤的診斷主要依據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)結(jié)合超聲，靜脈尿路照影，CT等手段。對(duì)

3、于腎母細(xì)胞瘤I或II期的患兒，主要還是以手術(shù)治療或化療為主；而對(duì)于晚期病例則需要擴(kuò)大治療，輔以化療，甚至放療。多數(shù)病例雖然得以確診，卻因不能早期診斷，貽誤最佳治療時(shí)機(jī)而影響預(yù)后。
　　目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的日趨成熟，為惡性腫瘤的相關(guān)研究提供了新的思路。如今應(yīng)用最廣泛的蛋白組學(xué)技術(shù)是表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用是其核心技術(shù)，它的主要特點(diǎn)就是可以從生物和臨床樣品中快速提供蛋白質(zhì)

4、表達(dá)譜的能力。腫瘤標(biāo)志物既能夠作為患者早期診斷的有力證據(jù)，又能夠作為后期療效的監(jiān)測指標(biāo)。在本課題組前期的研究過程中，我們已經(jīng)通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定了腎母細(xì)胞瘤血清中的腫瘤標(biāo)志物，但是，腎母細(xì)胞瘤瘤體組織中是否存在與血清中類似的蛋白質(zhì)標(biāo)記物尚不清楚。另外，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的各個(gè)階段，炎癥也起到一定的推動(dòng)作用，在腫瘤患者的血清中，可以檢測到某些炎癥因子的參與，其可能干擾腫瘤的診斷和監(jiān)測。所以，在篩選和鑒定腫瘤標(biāo)志物過程中，有必要剔除

5、炎癥因子的干擾。
　　另外僅僅排除和腫瘤相關(guān)的炎癥因子也不足以排除炎癥因子的干擾，本研究選取SIRS患兒血清作為對(duì)照組，擴(kuò)大剔除的炎癥因子范圍。全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）：是因?yàn)闄C(jī)體受到感染或非感染的病因，導(dǎo)致機(jī)體自我持續(xù)放大和自我破壞的而失控的全身性炎癥反應(yīng)。全身炎癥反應(yīng)綜合征是機(jī)體在修復(fù)和生存的過程中出現(xiàn)過度的應(yīng)激反應(yīng)的一種臨床過程。與此同時(shí)，

6、機(jī)體和組織會(huì)釋放大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，在病人的血液循環(huán)中早期可以發(fā)現(xiàn)如IL-1，TNF，MIP；接著會(huì)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子，中性細(xì)胞脫顆粒物，補(bǔ)體片段，花生四烯酸衍生物，還有多種趨化因子。
　　本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測腎母細(xì)胞瘤患兒血清，健康對(duì)照組血清，同時(shí)與重癥感染患兒對(duì)照組血清進(jìn)行對(duì)比，最大程度剔除炎癥因子的干擾，篩選出特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，運(yùn)用高效液相色譜技術(shù)（

7、HPLC）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，并用二維液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜（2D-LC-LTQ-MS）聯(lián)用系統(tǒng)技術(shù)對(duì)篩選出的特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，以期與前期的研究結(jié)果相契合。同時(shí)，為了驗(yàn)證在腎母細(xì)胞瘤瘤體組織中是否存在相似的非炎癥性蛋白質(zhì)標(biāo)記物，本研究通過表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測腎母細(xì)胞瘤患兒瘤體組織總蛋白，正常腎組織總蛋白，同時(shí)與重

8、癥感染患兒對(duì)照組血清進(jìn)行對(duì)比，剔除炎癥因子的干擾，篩選出特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳（TRICINE-SDS-PAGE）技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，收集目標(biāo)蛋白。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）技術(shù)鑒定目標(biāo)蛋白。所以，本研究的目的就是最大程度排除炎癥因子的干擾，篩選和鑒定腎母細(xì)胞瘤血清及其瘤體組織中特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物。
　　材料與方法:
　　2.1實(shí)驗(yàn)材料
　　2.1.1

9、臨床病例資料
　　本研究收集170例血清和85例組織標(biāo)本均從鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院獲得。其中腎母細(xì)胞瘤組血清50例，平均年齡2.9±0.1歲，男性28例，女性22例；正常對(duì)照組血清60例，平均年齡3.2±0.1歲，男性34例，女性26例；SIRS對(duì)照組60例，平均年齡3.1±0.1歲，男性37例，女性23例。外周靜脈血標(biāo)本均抽取于患兒清晨空腹時(shí)，室溫下靜置1h，3000r/min離心10min，收集血清樣本，儲(chǔ)存于-80℃冰箱，保存

10、備用。收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年至2013年腎母細(xì)胞瘤患兒術(shù)后瘤體組織45例，其中男性23例，女性22例，平均年齡2.8±0.1歲。收集患兒癌旁正常腎組織40例（根治性手術(shù)31例，姑息性切除9例）作為正常對(duì)照組，男性22例，女性18例，平均年齡2.9±0.1歲。正常對(duì)照組，SIRS對(duì)照組與腎母細(xì)胞瘤組年齡、性別相匹配。相關(guān)結(jié)果得到2位以上的病理學(xué)專家證實(shí)經(jīng)手術(shù)及組織穿刺活檢病理診斷為腎母細(xì)胞瘤。收集的組織樣本，儲(chǔ)存于-80℃冰箱

11、，保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)同意，且受試者均簽署有知情同意書。
　　2.1.2主要試劑及儀器
　　尿素、NaAC、芥子酸(SPA)、二硫蘇糖醇(DTT)、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)和胰蛋白酶均來自美國Promega公司。SELDI-TOF-MS、Ciphergen PBS II和WCX2蛋白質(zhì)芯片均來自美國Ciphergen公司。胰島素、細(xì)胞色素C、碘乙酰胺(IAM)、乙腈、α-氰基-4-羥

12、基肉桂酸(CHCA)、NH4HCO均來自美國Sigma公司。RNeasy Plus Micro Kit試劑盒、RNAprep pure Tissue Kit購自北京Qiagen公司。
　　PBS II+型SELDI-TOF-MS和Bio-processor：弱陽離子交換芯片（WCX2）蛋白質(zhì)芯片工作平臺(tái)均來自于美國CiphergenBiosystem公司；HPLC來自于日本Shimadzu公司，其中C18（250*4.6mm）色譜

13、柱來自于德國Sunchrom公司；MALDI-TOF/TOF-MS系統(tǒng)來自于德國BioRad公司；2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)來自于美國Thermo Electron公司。
　　2.2實(shí)驗(yàn)方法
　　2.2.1組織總蛋白的提取
　　以下操作均在冰上進(jìn)行：1.將低溫保存的組織樣本進(jìn)行稱重。2.加入細(xì)胞裂解液。組織樣本與細(xì)胞裂解液比例一般為100mg：500μl，然后加入蛋白酶抑制劑2ul。3.用組織勻漿器把腫瘤組織勻漿，至

14、無明顯肉眼可見固體。4.將組織勻漿吸入另外一個(gè)預(yù)冷的干凈離心管內(nèi)，4℃14000g/min離心25~30mins。5.最后將上清液轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。上述蛋白提取物分裝后，標(biāo)記清楚于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　2.2.2腎母細(xì)胞瘤血清及其瘤體組織中蛋白質(zhì)的篩選
　　冰浴中解凍血清和瘤體組織總蛋白標(biāo)本，在4℃下10000r/min離心2min。將96孔板放置于冰盒上，然后，每孔加入5μl血清和瘤體組織總

15、蛋白樣本，U9(9mol/L尿素)，1%Bar，2%CHAPS10μl，在4℃層析柜中600r/min振蕩30min。在震蕩結(jié)束前留15 min進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片的預(yù)處理，將蛋白質(zhì)芯片裝入Bioprocessor加樣器中，記錄下蛋白質(zhì)芯片的號(hào)碼，每孔加入NaAC(100mmol/L，pH4)200μl，放入層析柜中600r/min振蕩2min，重復(fù)以上操作1次。經(jīng)過U9處理后的96孔板置于冰盒上，用排槍加入NaAC185μl，層析柜中4℃6

16、00r/min震蕩2min。取已處理的樣本100μl加到蛋白質(zhì)芯片上，置于層析柜中4℃600r/min結(jié)合1h，甩去殘液，快速拍干。然后加入NaAC200μl，600r/min振蕩5min后，甩去殘液，快速拍干，重復(fù)操作3次。接著用去離子水200μl沖洗各孔2次，甩干殘液。待蛋白質(zhì)芯片風(fēng)干后，每孔加入50%飽和的SPA1μl，分兩次完成，干燥后即可上機(jī)待檢測。
　　2.2.3數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　質(zhì)譜分析的原始數(shù)據(jù)先經(jīng)過

17、濾噪音和聚類分析處理，將初步篩選出的質(zhì)荷比峰值數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗(yàn)。初步篩選出的m/z峰值是分析數(shù)據(jù)的對(duì)像，隨后，需要將不同組別間的質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α=0.01；腎母細(xì)胞瘤術(shù)前血清組、正常對(duì)照組血清、瘤體組織組、正常腎組織組及SIRS對(duì)照組血清間的差異性峰值進(jìn)行分析比對(duì)，找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白（數(shù)據(jù)結(jié)果存在0.3%偏差），即聚類分析。其既與正常對(duì)照組存在特異性，又與炎性對(duì)照組存在特異性，再提

18、出與15種與腫瘤相關(guān)的炎性因子，這樣就在最大程度上排除了炎癥因子對(duì)于篩選腎母細(xì)胞瘤特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的干擾。
　　2.2.4腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性標(biāo)記物的純化
　　在實(shí)驗(yàn)前取出凍存于-80℃冰箱中的分裝的血清樣品，放置于冰盒上慢慢解凍。吸取血清樣品100μl，加入去離子水300μl和乙腈600μl，充分振蕩混勻后，放置于4℃下，以便使血清中的大分子蛋白得到充分沉淀。等待30min后取出樣品，在4℃的環(huán)境中，在10000rpm

19、的轉(zhuǎn)速下離心30min。丟棄沉淀，收集上清液，將液體真空干燥濃縮至體積小于50μl，然后加入H2O/0.1%TFA450μl，充分振蕩混勻后，用自行裝填的C18固相萃取小柱對(duì)其進(jìn)行脫鹽。
　　采用C18反相高壓液相色譜柱對(duì)經(jīng)上述處理后的血清樣品進(jìn)行分離。H2O/0.1%TFA為流動(dòng)相A，ACN/0.09% TFA為流動(dòng)相B。加注樣品前，先用流動(dòng)相B對(duì)色譜柱進(jìn)行活化15min，再用流動(dòng)相A對(duì)柱體平衡30min，然后通過自動(dòng)進(jìn)樣器上樣

20、。洗脫步驟為：100%流動(dòng)相A和20-40%流動(dòng)相B梯度各15min，40-70%流動(dòng)相B梯度為50min，用100%流動(dòng)相B沖洗柱體10min。整個(gè)過程中流速設(shè)置為0.5 ml/min，檢測波長設(shè)置為214nm、254nm和280nm。用離心管分別收集各峰組分，記錄好時(shí)間和順序，將收集樣品真空濃縮至體積小于20μl。對(duì)初步分離后的血清樣品和HPLC分離所得各組分進(jìn)行MALDI-TOF-MS的線性模式檢測。
　　2.2.5腎母細(xì)胞

21、瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物的純化
　　選取0.75mm的制膠玻璃，使下端邊緣對(duì)齊，用配套的玻璃夾夾緊，然后放置膠架上，將玻璃的下端與膠墊充分接觸，防止加入的制膠液體發(fā)生泄漏。先配制的分離膠加入至玻璃的2/3，再加入異丙醇使液面水平，靜置約1.0h-1.5h，待其凝固后吸干異丙醇，再加入配制的濃縮膠，選用配套的梳子小心插入，防止氣泡產(chǎn)生，再次靜置大約1.0h，等待膠體凝固，然后放入電泳槽，加入配制的電泳液，小心拔出梳子，準(zhǔn)備加入樣

22、品。把前期去除大分子蛋白并濃縮后的組織總蛋白質(zhì)樣本加入指示劑5ul，在沸水中煮沸樣品10min，取出后再次5000r/min離心5min。取10ul上清液小心加至膠體梳子的齒槽中，第一泳道加入Marker，對(duì)應(yīng)相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量，作為觀察標(biāo)尺，后面的泳道依次加入蛋白質(zhì)樣本，且應(yīng)詳細(xì)記錄。然后連接電泳儀，準(zhǔn)確正負(fù)極。在濃縮膠時(shí)，電壓設(shè)定為30v，當(dāng)指示劑接近至濃縮膠與分離膠交界處時(shí)，將電壓調(diào)到90v。大約5h小時(shí)后，指示劑接近分離膠膠體底

23、部時(shí)，關(guān)掉電泳儀，取出玻璃，小心分離濃縮膠和分離膠，防止破裂，把濃縮膠小心切除。然后，小心分離分離膠，放置到清潔的托盤中，倒入考馬斯亮藍(lán)染色劑，震蕩過夜，進(jìn)行染色。染色結(jié)束后，用去離子水清洗干凈，再加入脫色液，震蕩4-6小時(shí)進(jìn)行脫色，等待膠體顏色完全脫凈后，再用去離子水清洗干凈，最后在膠體上顯示出目標(biāo)藍(lán)色條帶。將膠體放置超凈工作臺(tái)，帶上無菌口罩、帽子及手套，小心切下目標(biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)條帶，并將條帶切碎，分裝至不同EP管，做好標(biāo)記，分別記錄具

24、體蛋白質(zhì)條帶信息，整個(gè)過程務(wù)必保證在冰面上進(jìn)行。然后對(duì)顯示的目標(biāo)條帶進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測，最終確定膠體上目標(biāo)條帶。
　　2.2.6腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性蛋白標(biāo)記物的鑒定
　　取對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白質(zhì)樣品20μl，然后加入60μl8M尿素，使其最終濃度為6M，室溫振蕩20min使其充分溶解；再加入0.8μl1M DTT，使其最終濃度為10mM，室溫放置1h；然后加入3.2μl1M IAM，使其最終濃度為40mM，避光放置

25、45min；再加入3.2μl1M DTT，使其最終濃度為40mM，室溫放置30min；最后加入400μl50 mM NH4HCO3以稀釋樣品，將尿素最終濃度降到1M，pH值控制到大約為8.0。每份樣品中加入胰酶0.08μg，于37℃水浴下酶解過夜，然后加入0.2%TFA溶液，使樣品溶液pH值下降至6.0以下，以終止樣品酶解反應(yīng)。然后以12000g離心樣品溶液10min，吸取上清液，使其真空濃縮至體積小于10μl，再將樣品加入到C18蛋白

26、質(zhì)樣品檢測的梯度洗脫柱中。將2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)的噴霧系統(tǒng)與加樣后的樣品柱和梯度洗脫柱相串聯(lián)，進(jìn)行肽質(zhì)荷比圖譜的檢測。最后，將檢測結(jié)果錄入SEQUEST檢索程序，在Bioworks數(shù)據(jù)庫檢索與檢測結(jié)果肽段及氨基酸相匹配的可能蛋白質(zhì)。
　　2.2.7腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物的鑒定
　　在對(duì)應(yīng)EP管中加入wash buffer80ul，37℃震蕩蛋白質(zhì)樣品20min，吸取洗脫液，加入新的wash buffer

27、，重復(fù)操作三次，直到膠體的藍(lán)色洗去，接近白色透明狀。然后將膠體放入振蕩器，溫度升至90℃，膠體干燥15min。然后加入Digest Buffer20ul和稀釋的Reducing agent2 ul，將其充分混勻。然后，37℃水浴10 min。離開水浴后，使其溫度自然降至室溫，加入Blocking agent2ul，充分混勻。在室溫中靜置10min。然后加入稀釋的胰蛋白酶0.5ul，充分混勻，使最終胰蛋白酶的濃度達(dá)到8ng/ul。務(wù)必確保

28、使膠體完全沉浸在液體中，5000r/min離心5min。37℃振蕩12-14h過夜。最后，放入離心機(jī)，10000r/min離心10-15min，小心將上清液移至新的EP管中，同時(shí)在管壁上做好標(biāo)記，書面記錄。
　　在蛋白芯片板靶環(huán)上加入1ul酶解樣本，室溫干燥后加入1ul基質(zhì)，先對(duì)MALDI-TOF/TOF經(jīng)過校正后，然后經(jīng)激光解吸電離，收集到相應(yīng)的肽段質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過Mascot搜索軟件，再與Swissprot數(shù)據(jù)庫連接，搜索相匹配

29、的蛋白質(zhì)。
　　2.2.8 RT-PCR驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物在組織中的基因表達(dá)
　　使用RNAprep pure Tissue Kit提取腫瘤組和正常組組織中的RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit以RNA為模板合成first-strand cDNA。在Real-time PCR過程中使用Scientific Maxima SYBR Green q

30、PCR Master Mixes檢測腫瘤組和正常組的first-strand cDNA擴(kuò)增情況，分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。PCR過程中目標(biāo)蛋白Profilin-1的引物：Forward5′-ACGCCTACATCGACAACCTC-3′；Reverse5′-TGATGTTGACGAACGTTTTCC-3′。PCR過程中目標(biāo)蛋白Ubiquitin的引物：Forward5'-GTCACTAAGCCATCGGTCGT-3'；Reverse5'-A

31、CACGGACA CAACCAGTTCA-3'。PCR反應(yīng)使用兩步法：50℃ UDG預(yù)處理2min，95℃預(yù)變性10min；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的組成為95℃變性15sec、60℃引物退火30sec、72℃引物延伸30sec。使用Molecular Analyst software軟件分析PCR聚合物，使用標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算目標(biāo)蛋白基因?qū)τ讦?actin的比值。
　　2.2.9 ELISA驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性蛋白標(biāo)記物在血清中的

32、表達(dá)
　　使用Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay（ELISA）檢測腫瘤組血清和正常組血清中的APOC-I蛋白質(zhì)表達(dá)情況。首先配制0pg/ml，62.5pg/ml，125pg/ml，250pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml和4000 pg/ml的APOC-I凍干標(biāo)準(zhǔn)品各100μL，然后加入預(yù)包被抗人APOC-I抗體的96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；腫瘤組血清和正常組血清蛋

33、白樣品各取10個(gè)，稀釋100倍后，每孔按100μL加入預(yù)包被抗人APOC-I抗體的96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，孵育酶標(biāo)板。吸去各孔液體后，加入100μL生物素標(biāo)記的抗人APOC-I抗體，孵育酶標(biāo)板；洗板后，加入ABC工作液，孵育酶標(biāo)板；洗板后，每孔加入TMB顯色液90μL，孵育后每孔加入TMB終止液100μL終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀調(diào)整到450nm，讀出各孔吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品的濃度。
　　2.2.10

34、 ELISA驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物在組織中的表達(dá)
　　使用Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay（ELISA）檢測腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質(zhì)表達(dá)情況。首先配制0pg/ml，62.5pg/ml，125pg/ml，250pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml和4000 pg/ml的Ubiquitin和Profilin-

35、1凍干標(biāo)準(zhǔn)品各100μL加入預(yù)包被抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體的96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；腫瘤組和正常組組織總蛋白樣品各取10個(gè)，稀釋100倍后，每孔按100μL加入預(yù)包被抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體的96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，孵育酶標(biāo)板。吸去各孔液體后，加入100μL生物素標(biāo)記的抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體，孵育酶標(biāo)板；洗板后，加入ABC工作液，孵育酶標(biāo)板；洗板后，每孔加入T

36、MB顯色液90μL，孵育后每孔加入TMB終止液100μL終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀調(diào)整到450nm，讀出各孔吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品的濃度。
　　結(jié)果:
　　3.1腎母細(xì)胞瘤血清標(biāo)記物的篩選
　　通過SELDI-TOF-MS對(duì)預(yù)處理的腎母細(xì)胞瘤患兒血清、健康對(duì)照組血清和重癥感染患兒血清檢測后，得到一系列蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)和炎癥因子峰值及其分解的肽段峰值。這些蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)按照病例組、正常對(duì)照組及炎癥

37、對(duì)照組進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)(P＜0.01)，將差異性蛋白質(zhì)峰值篩選出來。其中：病例組血清與正常對(duì)照組血清中篩選出37個(gè)差異性蛋白質(zhì)峰值，35個(gè)蛋白質(zhì)峰值在正常對(duì)照組中高表達(dá)，2個(gè)蛋白質(zhì)峰值在病例組中高表達(dá)；病例組血清與炎癥對(duì)照組血清中篩選出27個(gè)差異性蛋白質(zhì)峰值。將以上兩組差異性蛋白進(jìn)行對(duì)比，找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白（數(shù)據(jù)結(jié)果存在0.3%偏差），篩出m/z位于6438Da的蛋白質(zhì)或肽段。其既與正常對(duì)照組存在特異性，

38、又與炎性對(duì)照組存在特異性，再提出與15種與腫瘤相關(guān)的炎性因子，在最大程度上排除了炎癥因子對(duì)篩選腎母細(xì)胞瘤特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的干擾，確定了腎母細(xì)胞瘤非炎癥性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的m/z為6438Da。
　　3.2腎母細(xì)胞瘤瘤體組織標(biāo)記物的篩選
　　通過SELDI-TOF-MS預(yù)處理的腎母細(xì)胞瘤腫瘤組組織蛋白、正常對(duì)照組蛋白檢測后，得到一系列蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)及其分解的肽段峰值。這些蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)按照腫瘤組、正常對(duì)照組進(jìn)行Wilcoxon秩

39、和檢驗(yàn)(P＜0.01)，將差異性蛋白質(zhì)峰值篩選出來。其中，腫瘤組與正常對(duì)照組中篩選出50個(gè)差異性蛋白質(zhì)峰值，21個(gè)蛋白質(zhì)峰值在正常對(duì)照組中高表達(dá)，29個(gè)蛋白質(zhì)峰值在腫瘤組中高表達(dá)；腫瘤組組與炎癥對(duì)照組中篩選出50個(gè)差異性蛋白質(zhì)峰值。將以上兩組差異性蛋白進(jìn)行對(duì)比，找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白（數(shù)據(jù)結(jié)果存在0.3%偏差），篩出m/z位于8350Da和5363Da的蛋白質(zhì)或肽段。其既與正常對(duì)照組存在特異性，又與炎性對(duì)照組存在特異性，

40、再提出與15種與腫瘤相關(guān)的炎性因子，在最大程度上排除了炎癥因子對(duì)篩選腎母細(xì)胞瘤特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的干擾，得到m/z峰位于8350Da和5363Da蛋白質(zhì)標(biāo)記物兩個(gè)。
　　3.3腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性標(biāo)記物的純化及鑒定
　　應(yīng)用HPLC法分離純化病例組血清樣本中的m/z為6438Da的特異性標(biāo)記物蛋白，同時(shí)將HPLC法得到的不同峰值的蛋白質(zhì)及肽段分裝并進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測，根據(jù)MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖找

41、出m/z為6438Da(SELDI-TOF-MS結(jié)果存在0.3%的差異)蛋白質(zhì)或肽段樣品。
　　將檢測出的m/z為6438Da的蛋白質(zhì)或肽段樣品分別酶解及通過2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)檢測肽段。m/z為6438 Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為：E.LK EFGNTLEDKA RELISRIKQS ELSAKMREWF SETFQKVKEK.G，通過將肽段導(dǎo)入SEQUEST檢索程序并在Bioworks數(shù)據(jù)庫檢索，此肽段為載脂蛋白C-I

42、(apolipoprotein C-I, APO C-I)的一個(gè)肽段。最后利用SEQUEST檢索程序統(tǒng)計(jì)兩種肽段在其鑒定的目標(biāo)蛋白質(zhì)中的覆蓋率。
　　3.4腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性標(biāo)記物的純化及鑒定
　　通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離純化，根據(jù)Marker提供的參照標(biāo)尺，確定膠體上目標(biāo)條帶（圖3）。同時(shí)將目標(biāo)蛋白質(zhì)及肽段進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測，根據(jù)MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖(圖4)找出m/

43、z為5363Da和8350Da(SELDI-TOF-MS結(jié)果存在0.3%的差異)蛋白質(zhì)或肽段樣品。
　　根據(jù)Marker提供的參照標(biāo)尺，在對(duì)應(yīng)的分子量上，切除目標(biāo)條帶，酶解離心后，取上清液，利用MALDI-TOF/TOF平臺(tái)對(duì)得到肽段混合物并進(jìn)行檢測。m/z為5363 Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為：K.IQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLS DYNIQKESTLHLVLRLR.G。通過將肽段導(dǎo)入Mascot檢索程序

44、并在Swissprot數(shù)據(jù)庫檢索，此肽段為泛素(Ubiquitin，UBIQ)的一個(gè)肽段。m/z為8350 Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為：K.DSPSVWAAVPGKTFVNITPAEVGVLVGKDRSSFYVNGLTLGGQKCSVIRDSLLQDGEFSMDLRTKSTGGAPTFNVTVK.T。通過將肽段導(dǎo)入Mascot檢索程序并在Swissprot數(shù)據(jù)庫檢索，此肽段為前纖維蛋白-1(Profilin-1，PFN1)的一個(gè)肽段。<

45、br>　　3.5 ELISA驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性蛋白標(biāo)記物在血清中的表達(dá)
　　我們使用ELISA對(duì)腫瘤組血清和正常組血清中的APO C-I蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行檢測。通過標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值數(shù)據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品的吸光值帶入公式得到腫瘤組和正常組組織中的APO C-I蛋白質(zhì)的濃度，結(jié)果表明APO C-I在腫瘤組中低表達(dá)，在正常組中高表達(dá)。
　　3.6 RT-PCR驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物在組織中的基因表達(dá)<

46、br>　　為了驗(yàn)證MALDI-TOF-TOF鑒定的目標(biāo)蛋白質(zhì)就是Ubiquitin和Profilin-1，我們使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Ubiquitin和Profilin-1基因進(jìn)行檢測，通過Real-time PCR分析表明，Ubiquitin基因在腫瘤組組織中低表達(dá)，在正常組組織中高表達(dá)；Profilin-1基因在腫瘤組組織中高表達(dá)，在正常組組織中低表達(dá)。
　　3.7 ELISA驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物在組織中的

47、表達(dá)
　　我們使用ELISA對(duì)腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行檢測。通過標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值數(shù)據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品的吸光值帶入公式得到腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質(zhì)的濃度，結(jié)果表明Ubiquitin在腫瘤組組織中低表達(dá)，在正常組組織中高表達(dá)；Profilin-1在腫瘤組組織中高表達(dá)，在正常組組織中低表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　通過本研究證

48、實(shí)了質(zhì)荷比為6438Da的蛋白質(zhì)或肽段為APO C-I，這種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在腎母細(xì)胞瘤患兒血清與正常組血清中均具有差異性，其結(jié)果與課題組前期的研究結(jié)果相契合；同時(shí)，本研究證實(shí)了質(zhì)荷比5363Da和8350Da的蛋白質(zhì)或肽段為泛素和前纖維蛋白-1，這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在腎母細(xì)胞瘤患兒瘤體組織與正常組組織中均具有差異性，也證實(shí)了腎母細(xì)胞瘤血清與組織中沒有相同或相似的蛋白質(zhì)標(biāo)記物；并且在此次研究中最大程度的剔除了炎癥因子對(duì)尋找腎母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)