鴨瘟病毒US2蛋白特性分析及小RNA干擾對(duì)US2基因功能影響初探.pdf

1、關(guān)于鴨瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV) US2基因的研究很少，本論文將本實(shí)驗(yàn)注冊(cè)的DPV-CHv株US2基因(GenBank Accession:EU195086)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，開(kāi)展原核表達(dá)、US2蛋白純化、兔抗蛋白抗體的制備等，然后分別通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot來(lái)檢測(cè)US2基因在DPV感染鴨胚成纖維細(xì)胞過(guò)程中轉(zhuǎn)錄水平的變化以及表達(dá)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。為了更清晰地揭示US2蛋白在細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)過(guò)程

2、，我們采用了間接熒光免疫方法來(lái)檢測(cè)US2的定位，同時(shí)通過(guò)病毒蛋白酶K實(shí)驗(yàn)鑒定了US2蛋白屬性。為了驗(yàn)證US2基因是否有抗原遞呈功能，用小RNA干擾載體來(lái)干擾US2基因的功能，然后用MHC ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)US2基因干擾前后的MHC水平的變化。
　　1.鴨瘟病毒US2基因的克隆、原核表達(dá)以及多抗的制備對(duì)鴨瘟病毒US2基因進(jìn)行序列分析、克隆及原核表達(dá)，并利用獲得的His重組蛋白分別制備了兔抗US2-IgG多克隆抗體，抗體瓊擴(kuò)效價(jià)

3、為1∶16。
　　2.鴨瘟病毒感染鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)后US2基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平、表達(dá)動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞定位分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)DPV感染DEF不同時(shí)期US2 mRNA的水平變化進(jìn)行熒光定量分析;并提取不同感染時(shí)期細(xì)胞蛋白，利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)US2蛋白在DEF中的表達(dá)水平變化。熒光定量結(jié)果表明:DPV感染DEF24h至72h，US2基因轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)上升，84h至96h US2 mRNA含量急劇下降，與對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄水

4、平相比，有明顯差異。免疫印跡結(jié)果表明，DEF感染DPV從48h開(kāi)始能明顯檢測(cè)到US2蛋白。間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)顯示DEF感染DPV從39h-50h，蛋白主要集中在細(xì)胞膜上，而且越來(lái)越多;從60h開(kāi)始集中在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周?chē)?，到?4h時(shí)，蛋白在細(xì)胞質(zhì)中明顯增多。
　　3.利用小RNA干擾US2基因的表達(dá)，檢測(cè)到被DPV感染的DEF細(xì)胞表面MHC的表達(dá)量有所減少針對(duì)US2ORF的不同靶區(qū)，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成4個(gè)shRNA載體以確保靶基因被有

5、效抑制。目的是篩選出有效的干擾shRNA來(lái)干擾DPV US2基因轉(zhuǎn)錄，為研究DPV US2基因的功能提供基礎(chǔ)。用熒光定量技術(shù)篩選出能有效干擾US2基因轉(zhuǎn)錄的RNA載體，然后干擾US2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，用MHC ELISA試劑盒檢測(cè)到DEF細(xì)胞表面上的MHC的表達(dá)量有顯著增加，該實(shí)驗(yàn)可以推斷DPV US2基因?qū)EF細(xì)胞表面的MHC抗原遞呈分子的表達(dá)有抑制作用。
　　4.用濃縮純化的病毒顆粒進(jìn)行病毒蛋白酶K實(shí)驗(yàn)證實(shí)了US2蛋白是皮層蛋白研究

6、鴨瘟病毒US2基因表達(dá)產(chǎn)物是否屬于結(jié)構(gòu)蛋白，屬于哪種結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)探索其基因編碼蛋白的功能、病毒的轉(zhuǎn)染、出芽、釋放等具有重要的意義。目前文獻(xiàn)中提到US2蛋白在皰疹病毒中屬于外膜或者皮層蛋白，但是對(duì)DPV的US2蛋白是哪種蛋白并沒(méi)有作探究。該實(shí)驗(yàn)利用高濃度蔗糖溶液來(lái)濃縮病毒粒子，然后分別用去垢劑SDS和蛋白酶K分別來(lái)溶解DPV的外膜脂溶性蛋白和其他蛋白成分，同時(shí)用已經(jīng)明確是皮層蛋白的UL51蛋白作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了US2蛋白在DPV中是