RNA干擾對HepG2細胞AFP基因表達的影響.pdf

1、山西醫(yī)科大學碩士學位論文RNA干擾對HepG2細胞AFP基因表達的影響姓名：張國英申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學指導教師：梁建芳20050606山西醫(yī)科大學碩士學位論文RNA干擾對HepG2$BflAFP基因表達的影響摘要目的：研究RNA干擾(RNAi)技術對HepG2細胞AFP基因表達的影響，以及抑制AFP表達后對HepG2細胞增殖及凋亡作用的影響。方法：第一部分RNA干擾(RNAinterferenceRNAi)抑制HepG2細胞A

2、FP基因表達方法的建立。l_目標基因序列的選擇及質粒載體構建，經(jīng)B1ast軟件查對及序列同源性分析，選擇兩條目標基因序列——AFPl與AFP2，構建質粒載體pGenesi卜卜AFPl(含綠色熒光蛋白編碼序列)及pGenesi卜2一AFP2。2用陽離子脂質體META／質粒載體pGenesil一1AFPI不同劑量及濃度配比轉染HepG2細胞，熒光顯微鏡觀察轉染效率，并檢測細胞培養(yǎng)上清液AFP的量的變化，篩選出最佳陽離子脂質體META／質粒載

3、體pGenesil一卜AFPl配比。第二部分RNA干擾技術對HepG2細胞AFP基因表達的影響。1轉染試劑METAFECTENE／質粒載體混合液配制及轉染細胞。2采用微粒子化學發(fā)光免疫分析法檢測轉染后24，48，72小時培養(yǎng)上清液中AFP的含量。3采用間接免疫細胞化學技術觀察處理組和對照組細胞內AFP基因表達情況，了解在細胞水平pGenesi卜AFPsiRNA對AFP表達的抑制作用。第三部分siRNA抑制AFP表達對HepG2細胞增殖及

4、凋亡的影響。分別應用MTT比色法，DNAFragmentation及檢測細胞內cAMP水平來觀察。結果：1篩選出最佳的陽離子脂質體META／質粒載體pGenesil一1一AFPl轉染復合物的配比為8ul：2511g。2轉染pGenesi卜卜siAFPl與pGenesil—2一siAFP2的實驗組與對照組比較，AFP含量下降明顯(PO01)：pGenesil一卜siAFPl實驗組與pGenesi卜2一siAFP2實驗組比較，AFP含量在各

5、時段均顯著下降。3pGenesi卜卜siAFPl的實驗組干擾后DNAFragmentation觀察無細胞凋亡，但是MTT比色法發(fā)現(xiàn)siRNA—AFPl的實驗組對細胞增殖有明顯的抑制作用，對細胞增殖抑制率最高達5135％。。而且實驗組細胞內的camp濃度(1564umol／h)明顯低于各對照組細胞內的cAMP濃度(PO01)。結論：RNA干擾技術能有效地抑制HepG2細胞AFP基因表達，這種方法不僅對體外研究AFP基因功能有一定意義，而且