貓皰疹病毒Ⅰ型US3基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析.pdf

1、貓皰疹癇毒Ⅰ型(Feline herpesvirus1，F(xiàn)HV-1)屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科，是貓病毒性鼻氣管炎的病原。貓是其自然宿主，可以引起發(fā)熱、眼部及鼻部粘膜損傷和明顯的上呼吸道感染癥狀，發(fā)病率高達(dá)100％，死亡率可達(dá)50％。FHV-1 US3基因存在于所有α-皰疹病毒中且高度保守，編碼絲/蘇蛋白激酶，是重要的毒力基因之一。其有促進(jìn)病毒包膜與核外膜融合，釋放病毒核衣殼到細(xì)胞質(zhì)，完成第一脫膜過程;誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的解聚和

2、細(xì)胞骨架的重排;抗凋亡活性和增強(qiáng)病毒抵抗干擾素的作用。在單純皰疹病毒和偽狂犬病毒中，US3基因缺失病毒的病毒滴度比親本病毒的低10到30倍，感染細(xì)胞后形成噬斑的數(shù)量和大小都隨著干擾素濃度增加而顯著減少。然而US3基因在FHV-1病毒體內(nèi)外復(fù)制及調(diào)節(jié)致病性中的作用尚無相關(guān)報(bào)道，因此本研究構(gòu)建FHV-1 US3基因缺失株(rFHV-delUS3)，進(jìn)行生物學(xué)研究，為研究貓皰疹病毒Ⅰ型的致病機(jī)制及貓病毒性鼻氣管炎的的防控奠定基礎(chǔ)。
　　

3、首先制備FHV-1 US3蛋白多克隆抗體。通過PCR方法擴(kuò)增US3基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32-US3;然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，使用1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)His-US3重組蛋白。SDS-PAGE和Western blot試驗(yàn)表明，該重組蛋白為可溶性表達(dá)，并且具有較好的反應(yīng)原性。將切膠純化后的重組蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，間接ELISA檢測其效價(jià)達(dá)1∶10000以上。W

4、estern blot和間接免疫熒光(IFA)結(jié)果表明，制備的多克隆抗體能夠與US3蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為rFHV-delUS3的鑒定提供了實(shí)驗(yàn)材料。
　　其次以FHV-1 VR-814株為親本病毒，根據(jù)GenBank已發(fā)表的FHV-1 C-27株基因序列設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增位于US3基因兩側(cè)序列用于同源重組的左側(cè)同源臂(L)和右側(cè)同源臂(R)。將目的片段L和R克隆于已刪除CMV啟動(dòng)子的pcDNA3.1(+)載體，并在L與R之間

5、插入CMV-EGFP表達(dá)盒，獲得轉(zhuǎn)移載體pcDNA3.1-LR-EGFP;提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞12h后接種親本病毒;48h后收毒，通過噬斑篩選、純化US3基因缺失病毒。之后，通過PCR和Westernblot方法對(duì)rFHV-delUS3進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明FHV-1 US3基因缺失病毒株構(gòu)建成功。
　　最后為了明確rFHV-delUS3的生物學(xué)特性，進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性、對(duì)IFN-β啟動(dòng)子激活的影響、體外生長曲線和小鼠致病性試驗(yàn)。結(jié)

6、果顯示，rFHV-delUS3可在CRFK細(xì)胞上穩(wěn)定生長，傳至第10代時(shí)，病變細(xì)胞中仍可見綠色熒光。一步生長曲線及噬斑形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，與親本病毒相比，rFHV-delUS3形成的噬斑大小減小，且復(fù)制能力減弱。rFHV-delUS3基因編碼產(chǎn)物對(duì)IFN-β啟動(dòng)子的抑制能力明顯減弱。小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，親本病毒組小鼠存活率為75％，而rFHV-delUS3組小鼠存活率為100％，且rFHV-delUS3組小鼠肺臟組織中病毒DNA水平明