中國番茄黃化曲葉病毒AV2基因功能研究.pdf

1、中國番茄黃化曲葉病毒Y10分離物(Tomatoyellow leaf curl China virus,TYLCCNVY10)為雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬成員,已發(fā)現(xiàn)其在番茄和煙草等作物上造成嚴重危害。TYLCCNV Y10的基因組為單鏈環(huán)狀DNA分子,大小約為2.7 kb,共編碼六個蛋白,其中一個348 bp ORF編碼AV2蛋白,本論文研究發(fā)現(xiàn)該蛋白是RNA沉默抑制子。用pET-32a原核表達載體在大腸桿菌中表達了TYLCCNV

2、Y10 AV2蛋白,以Ni2+-NTA親和柱純化的重組蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔制備了TYLCCNV Y10 AV2蛋白的多克隆抗體。含有AV2和GFP基因的植物表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌共浸潤GFP16c本氏煙葉片,浸潤后6天(6 dpi)在紫外下觀察發(fā)現(xiàn)浸潤區(qū)有明顯綠色熒光,且浸潤區(qū)周圍有紅暈,說明AV2具有抑制GFP16c本氏煙GFP基因局部沉默的功能,但其不能抑制細胞到細胞的短距離沉默信號的傳導(dǎo)。而且,在共浸潤后30天時紫外下觀察發(fā)現(xiàn),G

3、FP16c本氏煙的系統(tǒng)葉仍發(fā)綠色熒光,說明AV2具有抑制GFP16c本氏煙GFP基因系統(tǒng)沉默的功能。進一步用農(nóng)桿菌浸潤實驗發(fā)現(xiàn)AV2能抑制GFP16c本氏煙GFP基因系統(tǒng)沉默信號的傳導(dǎo)。上述研究結(jié)果表明TYLCCNV Y10 AV2蛋白是RNA沉默抑制子。通過農(nóng)桿菌浸潤本氏煙進行AV2瞬時表達,在浸潤48小時后在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),AV2蛋白分布在細胞質(zhì)中,并聚集成不規(guī)則的細胞質(zhì)小體。將AV2構(gòu)建到PVX的表達載體pGR106上,經(jīng)