細(xì)胞硫氧還蛋白2與豬瘟病毒E2蛋白的相互作用及其對豬瘟病毒復(fù)制的調(diào)控作用.pdf

1、豬瘟(classical swine fever，CSF)被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須上報的動物烈性傳染病之一，臨床上以高熱稽留、高死亡率、免疫抑制和繁殖障礙為主要特征。CSF的病原是豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)。CSFV是黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）成員，該屬還包括牛病毒性腹瀉病病毒(bovine viral diarrhea virus，

2、BVDV)、綿羊邊界病病毒(border disease virus，BDV)等成員。CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白包括囊膜糖蛋白Erns、E1、E2和衣殼蛋白C。E2是CSFV重要的毒力因子和主要的保護(hù)性抗原，同時在病毒的吸附和侵入過程中發(fā)揮重要作用。但迄今為止有關(guān)E2蛋白與宿主細(xì)胞相互作用的研究很少。
　　本研究利用豬巨噬細(xì)胞cDNA酵母表達(dá)文庫和酵母雙雜交技術(shù)篩選與E2蛋白存在相互作用的宿主蛋白，獲得了17種與E2可能存在相互作用的宿主

3、蛋白，經(jīng)比較分析后選擇硫氧還蛋白2(thioredoxin2，Trx2)進(jìn)行深入研究。Trx2廣泛表達(dá)于豬的不同組織中。經(jīng)酵母共轉(zhuǎn)化驗證、GST pull-down試驗和原位鄰位連接試驗（in situ proximity ligation assay，PLA）證明，Trx2蛋白和CSFV E2蛋白存在直接的相互作用。激光共聚焦試驗證明，E2蛋白與Trx2蛋白共定位于胞漿。通過Trx2蛋白的三種截短突變體與E2蛋白的GST pull-d

4、own試驗結(jié)果表明，Trx2蛋白的硫氧還結(jié)構(gòu)域是其與E2蛋白相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。為研究Trx2蛋白對CSFV復(fù)制的調(diào)控作用，我們設(shè)計并合成特異性靶向Trx2蛋白的干擾性小RNA分子，通過RNA干擾下調(diào)PK-15細(xì)胞內(nèi)源性Trx2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，沉默Trx2蛋白可顯著促進(jìn)CSFV的增殖和基因組的復(fù)制;將CSFV感染慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)Trx2蛋白的PK-15細(xì)胞系，結(jié)果顯示，過表達(dá)Trx2蛋白后會顯著抑制CSFV的增殖和基因組的復(fù)制

5、。在CSFV感染后不同時間點(diǎn)利用Western blotting檢測細(xì)胞內(nèi)Trx2蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CSFV感染的PK-15細(xì)胞中Trx2蛋白表達(dá)量明顯低于對照組;用E2和Trx2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，結(jié)果顯示，Trx2蛋白的表達(dá)量隨E2蛋白表達(dá)量的增加而減少，這表明，CSFV感染能抑制Trx2蛋白的表達(dá)。
　　總之，本研究確定了Trx2蛋白與E2蛋白的相互作用及其關(guān)鍵區(qū)域，證實(shí)了Trx2蛋白對CSFV復(fù)制的抑制作用