鴨瘟病毒UL19基因截段表達(dá)、蛋白純化及抗體制備.pdf

1、本論文對(duì)鴨瘟病毒UL19基因（GenBank登錄號(hào):EU195092）進(jìn)行了如下研究:DPV UL19基因的生物信息學(xué)分析、UL19全基因的克隆與分段基因的原核表達(dá)、蛋白純化及抗體制備，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、鴨瘟病毒UL19基因的生物信息學(xué)分析
　　鴨瘟病毒UL19基因全長(zhǎng)4143bp，編碼1380個(gè)氨基酸，理論分子量為153.674kDa。蛋白相似性比對(duì)表明，該編碼蛋白是高度保守的，因此認(rèn)定UL19基因編碼該病毒的主

2、要衣殼蛋白。進(jìn)一步分析表明該多肽不含信號(hào)肽，不是分泌蛋白;存在跨膜區(qū)的概率極低，初步估計(jì)應(yīng)是膜外蛋白;疏水性區(qū)域分布廣泛且比較分散;該多肽主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，可能與衣殼在宿主細(xì)胞核內(nèi)裝配然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步加工成熟有關(guān);三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該多肽有一區(qū)域（第486-1050位）與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的3D結(jié)構(gòu)模型同源性較高。
　　2、鴨瘟病毒UL19全基因的克隆
　　由于UL19全基因序列較長(zhǎng)，PCR擴(kuò)

3、增該基因時(shí)易出現(xiàn)非特異性條帶，因此在擴(kuò)增條件的選擇時(shí)比較苛刻。將PCR擴(kuò)增出較純的片段送公司測(cè)序并構(gòu)建到pUC118-2載體，經(jīng)測(cè)序后基本正確。然后將該基因構(gòu)建到表達(dá)載體pGEX-4T-1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化不同的表達(dá)宿主菌以及各種條件摸索，并對(duì)相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行洗滌包涵體和過(guò)柱純化，最終都沒(méi)有得到理論值大小的重組蛋白，因此推測(cè)該基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中不易表達(dá)，可能的原因是在誘導(dǎo)過(guò)程中，由于片段較長(zhǎng)又無(wú)法正確折疊成高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使表達(dá)中

4、斷。
　　3、鴨瘟病毒UL19基因的原核表達(dá)、蛋白純化及抗體制備
　　經(jīng)過(guò)抗原表位分析，位于片段中間部分存在B細(xì)胞抗原表位的可能性較大。將該基因中間序列分成三個(gè)片段，分別進(jìn)行T克隆及亞克隆，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌中誘導(dǎo)表達(dá)，三種表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。經(jīng)過(guò)各種純化條件摸索，最終采用切膠純化與洗滌包涵體的方法進(jìn)行蛋白純化，可以得到比較純的蛋白。將純化后的蛋白免疫兔子制備多克隆抗體，并用瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定效價(jià)。三個(gè)分段蛋白測(cè)得的效